Wprowadzenie

Fluoropirymidyny są powszechnie wykorzystywanymi lekami cytotoksycznymi — szczególnie często stosowanymi w ramach chemioterapii u chorych na nowotwory układu pokarmowego, raki narządów regionu głowy i szyi oraz raka piersi. Najczęściej stosowanymi fluoropirymidynami są — w Polsce i na świecie — fluorouracyl i kapecytabina.

Fluoropirymidyny charakteryzuje skuteczność i toksyczność zależna od dawki. Najczęściej występujące działania niepożądane obejmują uszkodzenie błon śluzowych (przede wszystkim w obrębie przewodu pokarmowego) z tworzeniem owrzodzeń u części chorych, objawy zespołu ręka–stopa oraz mielotoksyczności (głównie neutropenia i małopłytkowość) i kardiotoksyczności. Poważna toksyczność fluoropirymidyn jest zjawiskiem niedoszacowanym w codziennej praktyce klinicznej — dane z piśmiennictwa wskazują, że zdarzenia niepożądane w przebiegu leczenia fluoropirymidynami występują u od 30% chorych w stopniu 3. do 5% w stopniu 4., a u 0,1–1% chorych kończą się zgonem. Wystąpienie nasilonych działań niepożądanych wcześnie — w ciągu pierwszych kilku dni — po zastosowaniu fluoropirymidyn oraz długotrwałość powikłań może być sygnałem, że toksyczność jest związana z niedoborem dehydrogenazy dihydropirymidynowej (DPD, dihydropyrimidine dehydrogenase) [1].

Przyczyną poważnej toksyczności fluroropirymidyn jest w około 60% przypadków niedobór lub brak aktywności DPD, która odpowiada za inaktywację 80–90% zastosowanej dawki fluoropirymidyny. Niedobór DPD powoduje gromadzenie toksycznych metabolitów fluoropirymidyn i zwiększenie ryzyka występowania poważnych działań niepożądanych [2].

Obecne opracowanie stanowi podsumowanie stanu wiedzy na temat toksyczności fluoropirymidyn związanej z niedoborem DPD oraz możliwości wykrywania wspomnianego zaburzenia w praktyce klinicznej.

Metabolizm fluoropirymidyn

Około 20% fluorouracylu zastosowanego dożylnie ulega wydaleniu z moczem, a pozostała część leku jest katabolizowana do nieaktywnych metabolitów. Około 20% wchłoniętej dawki fluorouracylu oraz kapecytabiny (pro-lek fluorouracylu) trafia do szlaku katabolicznego, w którym kolejne metabolity fluoropirymidyn są wbudowywane do kwasu rybonukleinowego (RNA, ribonucleic acid) lub dezoksyrybonukleinowego (DNA, deoxyribonucleic acid). Metabolity fluoropirymidyn powodują uszkodzenie kwasów nukleinowych oraz hamują jednocześnie aktywność syntazy tymidylanowej, co prowadzi do śmierci komórki [2]. Pozostałe 80% dawki fluoropirymidyn jest katabolizowane do 5,6 dihydrofluorouracylu (DHFU) pod wpływem DPD. Następnie, DHFU jest katalizowany do fluorob-ureidopropionianu przez dihydropyrimidynazę. Z kolei, fluorob-ureidopropionian jest katalizowany do fluoroB-alaniny przez ureidopropionazę. Fluorouracyl ma budowę chemiczną podobną do endogennych pirymidyn i ulega katabolizmowi w tych samych szlakach metabolicznych, co pozwala — między innymi — na ocenę aktywności DPD przez pomiar stężenia endogennych pirymidyn (przede wszystkim — uracylu, który ulega gromadzeniu przy niedoborze DPD) [2]. Szlaki metaboliczne endogennych i egzogennych pirymidyn i rolę DPD przestawiono w uproszczony sposób na rycinie 1 (rycina obrazuje, że kumulacja endogennego uracylu jest niemal tożsama z zaburzeniami katabolizmu fluorouracylu przez DPD).

Rycina 1. Metabolizm pirymidyn endo- i egzogennych wraz z rolą dehydrogenazy dihydropirymidynowej

Wskazania dotyczące diagnostyki niedoboru dehydrogenazy dihydropirymidynowej

Całkowity brak aktywności DPD występuje rzadko (0,01–0,05% populacji kaukaskiej), ale wiąże się ze zwiększonym ryzykiem groźnych dla życia działań niepożądanych fluropirymidyn. W związku z powyższym istotne jest zidentyfikowanie chorych o cechach fenotypowych lub genotypowych braku aktywności DPD w celu zaniechania stosowania fluoropirymidyn. Natomiast niedobór DPD wymaga oceny ryzyka powikłań zależnych — między innymi — od wariantu genu DPYD w obu jego allelach i modyfikowania założeń leczenia [3]. Najczęściej występujące warianty genu DPYD odpowiedzialne za niedobór DPD przedstawiono w tabeli 1. Prawie całkowita lub całkowita utrata aktywności DPD występuje u osób homozygotycznych oraz złożonych heterozygotycznych (np. w przypadku kombinacji niektórych wariantów z przynajmniej jednym allelem c.1905+1G>A lub c.1679T>G) [1, 2].

W opublikowanym w 2015 roku przeglądzie systematycznym i metaanalizie 8 badań oceniających związek wariantów genetycznych genu DPYD z ciężką toksycznością u 7365 chorych leczonych fluoropirymidynami stwierdzono istotny związek między zwiększoną częstością poważnych działań niepożądanych i genotypem c.1679T>G (p < 0,0001) i c.1236G>A/HapB3 (p < 0,0001) [4].

W prospektywnym badaniu kohortowym prowadzonym u 2038 chorych oceniano związek genotypu c.1905+1G>A z toksycznością fluoropirymidyn. Stwierdzono zmianę w jednym allelu genu DPYD u 22 chorych (osoby hetrozygotyczne), a toksyczność co najmniej 3. stopnia — u 5 spośród 18 (28%) leczonych [5].

Istotne znaczenie mają wyniki prospektywnej analizy kohorty, w której oceniano genotyp DPYD przed leczeniem celem adaptacji dawki do ryzyka działań niepożądanych. U 85 z 1103 ocenianych chorych stwierdzono obecność substytucji w jednym allelu genu DPYD. Poważne zdarzenia niepożądane związane z fluoropirymidyną wystąpiły odpowiednio u 33 spośród 85 (39%) nosicieli rzadkiego wariantu DPYD wobec 231 spośród 1018 (23%) chorych bez wymienionej zmiany genetycznej (p = 0,0013). Dawkowanie oparte na ocenie genotypu doprowadziło do zmniejszenia ryzyka poważnych toksyczności u nosicieli allela c.1905+1G>A do 1,31 z 2,87 w kontroli historycznej [6].

W celu poprawienia bezpieczeństwa chemioterapii francuska Narodowa Agencja Bezpieczeństwa Leków i Produktów Zdrowotnych (ANSM, Agence Nationale de Securite du Medicament et des Produits de Sante) zarekomendowała w 2018 roku wykonywanie genotypowaniu DPYD u wszystkich chorych przed leczeniem fluoropirymidynami. Natomiast w grudniu 2018 roku francuski Narodowy Instytut Nowotworów (INCa, Institut National Du Cancer) przedstawił zalecenie rutynowego oznaczania uracylu we krwi obwodowej w celu oceny pośredniej aktywności DPD względem uracylu endogennego. Określono, że stężenie 150 ng/ml i większe jest związane z dużym ryzykiem wystąpienia groźnych dla życia działań niepożądanych fluoropirymidyn i w tej grupie chorych zalecono odstępowanie od stosowania fluorouracylu lub kapecytabiny. Natomiast stężenie uracylu między 16 i 150 ng/ml zostało uznane za ekwiwalent częściowego niedoboru DPD, przy którym zalecono odpowiednią redukcję dawki fluoropirymidyn [1]. Do oceny ryzyka wystąpienia toksyczności może być także przydatna ocena proporcji dihydrouracylu do endogennego uracylu (wskaźnik UH2/U). Endogenny uracyl jest metabolizowany w wątrobie do dihydrouracylu przez DPD. Wysoki wskaźnik UH2/U jest związany z wyższym ryzykiem występowania działań niepożądanych fluoropirymidyn, chociaż wartość wskaźnika nie koreluje z klirensem osoczowym fluorouracylu [2].

W 2020 roku Europejska Agencja Leków (EMA, European Medicines Agency) — po analizie dostępnych informacji naukowych — opublikowała rekomendację dotyczącą testowania wszystkich chorych, u których planowana jest chemioterapia fluoropirymidynami w kierunku wariantów genetycznych genu DPYD warunkujących niedobór DPD [3].

Urząd Rejestracji Produktów Leczniczych i Biobójczych (URPLiB) — w następstwie rekomendacji EMA — opublikował komunikat skierowany do „fachowych pracowników służby zdrowia”, które potwierdza zalecenie EMA w zakresie potrzeby testowania genotypowego lub fenotypowego niedoboru DPD przed rozpoczęciem systemowego leczenia fluropirymidynami. Komunikat URPLiB zaleca rozważenie zmniejszenia dawki początkowej fluoropirymidyn i wymienia dodatkową metodę służącą poprawie wyników klinicznych, którym jest monitorowanie stężeń fluorouracylu w krwi w celu modyfikowania dawkowania i utrzymania dawki w indeksie terapeutycznym leku. Zaleca się utrzymanie dawki fluorouracylu zakresie pola pod krzywą (AUC, area under the curve) między 20 i 30 mg × godzina/l. W przypadku zastosowania zmniejszonej dawki początkowej w pierwszym cyklu bez monitorowania stężeń, można podjąć próbę eskalowania dawek do wartości należnych przy braku objawów toksyczności, ale pod warunkiem utrzymania zwiększonego nadzoru nad chorymi [7].

Brytyjska Narodowa Służba Zdrowia (NHS, National Health Service) opublikowała rekomendację wskazującą na konieczność genotypowania wariantów DPYD w celu identyfikacji chorych z całkowitym niedoborem DPD, u których leczenie fluoropirymidynami nie powinno być stosowane w obawie o powikłania zagrażające życiu. Brytyjski NHS zwraca również uwagę na konieczność rozważenia redukcji dawek fluoropirymidyn i zwiększonego nadzoru nad toksycznością u chorych z częściowym niedoborem DPD [8].

Należy pamiętać, że niedostateczna aktywność DPD nie jest jedyną przyczyną zwiększonej toksyczności fluoropirymidyn i wykluczenie niedoboru aktywności DPD nie zwalnia z bardzo starannego monitorowania działań niepożądanych leczenia, wspomniane niedobory odpowiadają bowiem jedynie za około 20% ciężkich działań niepożądanych fluoropirymidyn.

Metody diagnostyki niedoboru dehydrogenazy dihydropirymidynowej

Zasadnicze metody diagnostyczne w ocenie DPD obejmują diagnostykę fenotypową aktywności badanego enzymu oraz genotypowanie, w którym oceniane są 4 najczęstsze warianty genu DPYD związane z niedoborem DPD i toksycznością fluoropirymidyn.

Ocena stężenia endogennego uracylu i dihydrouracylu w osoczu krwi jest przeprowadzana najczęściej za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC, high-performace liquid chromatography) lub metodą spektrometrii masowej. Obie metody nie są powszechnie dostępne w polskich laboratoriach. Należy także pamiętać, że uracyl i jego metabolity nie są stabilne, a na wynik badania może mieć wpływ sposób pobrania i czas transportu materiału oraz inne problemy przedlaboratoryjne [2]. Badania genu DPYD — pod względem problemów przedlaboratoryjnych — obarczone są mniejszym błędem.

Najczęstsze warianty genu DPYD wymieniono w tabeli 1. Obecnie nie rekomenduje się badania tylko jednego — najczęstszego — wariantu c.1905+1G>A (DPYD*2A). Stwierdzono, że badanie jedynie wymienionego wariantu nie wystarcza do oceny ryzyka wystąpienia niedoboru DPD. Nie ma również oczywistych wskazań do badania bardzo rzadkich wariantów genu DPYD (DPYD*5 (T>C), DPYD*6 (C>T), DPYD*9A (A>G). Chorzy wymagają oznaczenia tylko raz przed planowanym stosowaniem fluoropirymidym (zalecenia NHS) [8].

Badanie wariantów genu DPYD należy przeprowadzić w materiale genetycznym wyizolowanym z leukocytów krwi obwodowej za pomocą zestawów do izolacji posiadających certyfikat do diagnostyki in vitro (IVD) [9–11].

W amerykańskich zaleceniach National Institute of Health (NIH) zawarto stwierdzenie, że do badania wariantów genu DPYD można zastosować różne metody od genotypowania pojedynczych zmian do sekwencjonowania całego genu. Do badania czterech najważniejszych wariantów genu DPYD najczęściej używa się techniki PCR (polymerase chain reaction), która zachodzi w czasie rzeczywistym (RT, real-time) w odpowiednim termocyklerze. Do diagnostyki in vitro dopuszczone są różne testy. Najprostsze opierają się na wykorzystaniu metody dyskryminacji allelicznej oraz sond molekularnych typu TaqMan znakowanych fluorochromami. Komercyjnie dostępne są również zestawy wykorzystujące technologię izotermicznej amplifikacji (LAMP, loop-mediated isothermal amplification). Podczas badania metodą LAMP etap denaturacji termicznej został wyeliminowany, a cały proces zachodzi w stałej temperaturze 64°C i protokół amplifikacji kwasów nukleinowych trwa jedynie 30 minut. Metoda LAMP wykorzystuje analizę krzywych topnienia produktu amplifikacji dla analizowanych sekwencji genów (HRM, high resolution melt), która jest nieco droższa od zwykłego badania RT-PCR. Jednak obie metody charakteryzuje prostota wykonania i brak konieczności posiadania drogiej aparatury [9–11].

Metoda sekwencjonowania pozwala badać dłuższe fragmenty DNA, co umożliwia wykrycie najczęstszych oraz rzadkich wariantów genu DPYD. Sekwencjonowanie bezpośrednie metodą Sangera umożliwia badanie stosunkowo krótkich odcinków DNA — metoda jest najtańsza, ale laboratorium musi zostać wyposażone w odpowiedni sekwenator kapilarny. Najbardziej zaawansowaną, najdroższą i najbardziej skomplikowaną technologią jest sekwencjonowanie nowej generacji (NGS, next-generation sequencing). Metoda NGS umożliwia badanie całych genów (zarówno sekwencji kodujących — eksonów, jak i niekodujących — intronów) lub tylko miejsc, w których występują mutacje. Stosowanie NGS w celu badania wariantów genu DPYD nie jest ekonomicznie uzasadnione, jeżeli nie stanowi części jednoczesnej oceny wielogenowej. Zalecenia NIH sugerują, że NGS może służyć do genotypowania DPYD, jeżeli wymieniony gen znajdzie się w panelu wykorzystywanym w diagnostyce — przykładowo — u chorych na zaawansowanego raka jelita grubego i odbytnicy, u których pochodne fluoropirymidyny mają szerokie zastosowanie i kwalifikacja do leczenia ukierunkowanego molekularnie obejmuje ocenę genów KRAS i NRAS oraz BRAF lub niestabilności mikrosatelitarnej [9–11].

Finansowanie genotypowania DPYD

Obecnie — według wiedzy autorów opracowania — możliwe jest finansowanie badań molekularnych różnych wariantów genu DPYD związanych z wysokim ryzykiem powikłań po fluoropirymidynach w ramach świadczeń odrębnie kontraktowanych lub badań genetycznych w chorobach nowotworowych, co wynika z Zarządzenia Prezesa Narodowego Funduszu Zdrowia (NFZ) nr 1/DSOZ/2022 (z późniejszymi modyfikacjami) w sprawie określania warunków zawierania i realizacji umów w rodzaju leczenie szpitalne oraz leczenie szpitalne — świadczenia wysokospecjalistyczne (załącznik nr ٧). Jeżeli badanie genu DPYD wykonujemy metodą RT-PCR lub sekwencjonowaniem metodą Sangera (do 6 amplikonów), to możliwe jest rozliczenie wymienionej procedury jako prostego badania genetycznego. W przypadku sekwencjonowania dłuższych fragmentów genów techniką Sangera lub NGS (od 6 do 40 amplikonów) procedura jest rozliczana jako złożone badanie genetyczne. Sekwencjonowanie wielu genów techniką NGS jest rozliczane jako najdroższe, zaawansowane badanie genetyczne. Obecna wycena badania pozwala na pokrycie kosztów w części podmiotów komercyjnych [12]. Bieżące zasady finansowania w poszczególnych podmiotach należy potwierdzić samodzielnie.

Podsumowanie

Niepożądane działania fluoropirymidyn mają wiele przyczyn. Niedobór DPD jest najlepiej poznaną przyczyną i ocena aktywności wymienionego enzymu może pomóc w określeniu ryzyka wystąpienia toksyczności i ograniczenia powikłań, które mogą być groźne dla chorych.

Ocena występowania całkowitego lub częściowego niedoboru DPD jest zasadna u wszystkich chorych przed rozpoczęciem leczenia fluoropirymidynami.

Metodą diagnostyczną zalecaną przez EMA i URPLiB jest genotypowanie 4 wariantów genu DPYD związanych z wysokim ryzykiem groźnej dla życia toksyczności fluoropirymidyn.

W przypadku dostępności oznaczania stężenia uracylu w krwi, uzyskane wyniki mogą także stanowić podstawę do decyzji klinicznych o stosowaniu i dawkowaniu fluoropirymidyn.

U chorych leczonych radykalnie decyzja o redukcji dawek w przypadku podejrzenia częściowego niedoboru DPD powinna uwzględniać stopień ryzyka powikłań fluoropirymidyn w celu uniknięcia nadmiernego obniżenia intensywności dawki, co może mieć wpływ na skuteczność leczenia i długość życia.

Konflikt interesów

P.S.: Udziały w podmiocie oferującym komercyjne usługi i produkty w zakresie medycznej diagnostyki laboratoryjnej (Genloxa Sp z o.o.).

T.K.: Wykłady dla firm BMS, MSD, Merck, niezwiązane z publikowanym artykułem.

B.R.: Honoraria od firm AstraZeneca, AMGEN, BMS, Gilead, Lilly, Merck, MSD, Novartis, Pfizer, Pierre-Fabre, Roche, Servier, niezwiązane z publikowanym artykułem.

Pozostali autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Piśmiennictwo