Wielkokomórkowe chłoniaki rozlane B-komórkowe (DLBCL, diffuse large B-cell lymphoma) są najczęstszymi nowotworami układu chłonnego u ludzi dorosłych, a zarazem niezwykle heterogenną grupą chorób. Ich molekularną substrukturę odzwierciedlają w znacznym stopniu biologiczne uwarunkowania, scharakteryzowane uprzednio na podstawie globalnego profilu ekspresji genów i algorytmu consensus clustering w dwóch niezależnych grupach chorych. Badania te wykazały, że w obrębie chłoniaków DLBCL można wyróżnić trzy podtypy o odmiennej genetycznej charakterystyce. Profil ekspresji najliczniejszej ze zidentyfikowanych grup, nazwanej „BCR” (B-cell receptor signaling), charakteryzowała nadekspresja genów kodujących białka receptora B-komórkowego i kaskady transdukcji sygnału z tego receptora, w tym SYK (Spleen Tyrosine Kinase) oraz niektóre B-komórkowe czyniki transkrypcyjne, w tym BCL6. W grupie “BCR” obserwowano również częstsze niż w innych podtypach translokacje regionu 3q obejmujące locus BCL6. Obserwacje te sugerowały, że wzrost i proliferacja komórek tego molekularnego podtypu DLBCL może zależeć od ścieżek sygnałowych zależnych od receptora BCR i/lub od programu transkrypcyjnego BCL6. W celu zbadania tej hipotezy, przeprowadzono badania oceniające rolę tonicznego sygnału zależnego od kinazy SYK i konsekwencji inhibicji transdukcji tego sygnału in vitro, mechanizmy kontrolujące aktywność kinazy SYK, mechanizmy transkrypcyjne czynnika transkrypcyjnego BCL6 i konsekwencje wyłączenia funkcji BCL6 in vitro oraz interakcję pomiędzy funkcją czynnika transkrypcyjnego BCL6 i aktywnością receptora BCR w chłoniakach o molekularnej charakterystyce „BCR”.
W przeprowadzonych badaniach wykazano, że zarówno linie komórkowe o charakterystyce molekularnej odpowiadającej chłoniakom typu „BCR”, jak i pierwotne izolowane komórki nowotworowe pobrane od części chorych, wykazują konstytutywną toniczną aktywność kinazy SYK i jej bezpośredniego substratu, białka adaptorowego BLNK (B-cell linker protein). Zastosowanie wysokospecyficznego, ATP-kompetycyjnego inhibitora R406 in vitro prowadziło do zahamowania tonicznej i aktywowanej ligandem aktywności receptora BCR (mierzonej jako fosforylacja BLNK84) i prowadziło do apoptozy badanych komórek. Badania te wskazują, że SYK-zależny toniczny sygnał receptora BCR jest ważnym czynnikiem warunkującym proliferację komórek chłoniakowych o molekularnej charakterystyce „BCR” i może być terapeutycznym celem dla małocząsteczkowego inhibitora SYK. Wykazano ponadto, że komórki wrażliwe na działanie tego inhibitora można zidentyfikować na podstawie ich globalnego profilu ekspresji genów.
Kluczowa rola SYK w transdukcji i amplifikacji sygnału z receptora BCR sugerowała, że aktywność tej kinazy pozostaje pod ścisłą fizjologiczną kontrolą. W drugiej części badań wykazano, że kinaza ta jest substratem dla tkankowo-swoistej izoformy fosfatazy PTPROt (Protein Tyrosine Phosphatase, Receptor–type O, truncated). Wymuszona ekspresja PTPROt prowadziła do zahamowania fosforylacji SYK indukowanej ligandem i dystalnej blokady w transdukcji sygnału do kinaz ERK1/2. Nadekspresja PTPROt prowadziła również do zahamowania proliferacji komórek, a w konsekwencji do ich apoptozy. Apoptotyczną śmierć komórek wskutek nadekspresji PTPROt obserwowano również przy braku aktywacji receptora BCR, co sugeruje, że fosfataza ta reguluje także toniczną aktywność SYK.
Drugą podstawową charakterystyką chłoniaków DLBCL typu „BCR” jest nadekspresja czynnika transkrypcyjnego BCL6 i częstsze translokacje dotyczące tego onkogenu. Obserwacje te sugerowały, że ekspresja BCL6 może być dodatkowym czynnikiem warunkującym wzrost w tym podtypie molekularnym DLBCL. Chłoniaki DLBCL zależne od szlaków molekularnych regulowanych przez BCL6 powinny wykazywać skoordynowany profil ekspresji genów kontrolowanych przez BCL6, odrębny od profilu chłoniaków niezależnych od BCL6. W celu zbadania tej hipotezy, przeprowadzono genomową analizę regionów promotorowych regulowanych przez BCL6. Wykazano, że geny kontrolowane przez BCL6 były istotnie częściej reprezentowane w grupie „BCR”. W badaniach przeprowadzonych na liniach komórkowych, proapoptotyczny efekt inhibicji funkcji BCL6 peptydem BPI (BCL6-peptide inhibitor) obserwowano wyłącznie w liniach typu „BCR”.
Unikalna wrażliwość linii komórkowych typu „BCR” na inhibicję BCL6 sugerowała istnienie nieznanego dotychczas związku między działaniem tego czynnika transkrypcyjnego a sygnałem zależnym od receptora BCR. Celem zbadania postulowanego związku, przeanalizowano wpływ czynnika transkrypcyjnego BCL6 na poziom transkrypcji genów kodujących białka biorące udział w proksymalnych etapach transdukcji sygnału z BCR. W izolowanych, wysoko oczyszczonych frakcjach prawidłowych limfocytów, w tym naiwnych, germinalnych i komórkach pamięci oraz w dwóch grupach pacjentów z DLBCL, ekspresja transkryptu BCL6 pozostawała w odwrotnej korelacji z ekspresją transkryptu PTPROt. W dalszych badaniach funkcjonalnych wykazano, że BCL6 jest represorem transkrypcji genu PTPROt i bezpośrednio wiąże się z jego regionem promotorowym. Wyłączenie funkcji BCL6 poprzez mechanizm interferencji RNA powodowało nadekspresję PTPROt, defosforylację SYK oraz zahamowanie transdukcji sygnału z receptora BCR tylko w liniach komórkowych typu „BCR”. BCL6 kontrolował promotor PTPROt również w prawidłowych izolowanych germinalnych limfocytach B, wskazując, że BCL6 jest fizjologicznym regulatorem przekazywania sygnału z BCR. Przeprowadzone badania identyfikują dotychczas nieznaną funkcję BCL6 w regulacji aktywności kompleksu receptora BCR oraz wskazują na istotny mechanizm wrażliwości na inhibicję BCL6, zależny od zahamowania aktywności kinazy SYK. Badania te sugerują również, że skojarzone zahamowanie szlaków sygnałowych zależnych od BCL6 i receptora B-komórkowego może mieć charakter synergistyczny u chorych z chłoniakami DLBCL o charakterystyce molekularnej “BCR”.