Wstęp: Wirus zapalenia wątroby typu B (HBV) oraz parvowirus B19 (B19V) badane są u dawców krwi, ten pierwszy u wszystkich dawców, drugi u dawców osocza przeznaczonego do produkcji immunoglobuliny anty-D oraz anty-HBs. Genotypy HBV, których dotychczas zidentyfikowano 8, różnią się dystrybucją geograficzną oraz przebiegiem zakażenia. Opisano mutacje zlokalizowane w genie S mające charakter mutacji ucieczki i prowadzące do obniżonej reaktywności antygenu powierzchniowego z przeciwciałami m.in. w testach diagnostycznych. W przypadku B19V obecnie znane są trzy genotypy. Opisano trudności w diagnostyce genotypu 2 i 3 manifestujące się wynikami fałszywie ujemnymi oraz zaniżaniem wyników badań ilościowych DNA B19V. Przebieg zakażenia oraz epidemiologia tych genotypów jest mało poznana.
Celem obecnego opracowania było przedstawienie wyników badania polimorfizmu wirusa B19V oraz HBV w Polsce. Szczegółowe badanie polimorfizmu HBV prowadzono w osoczu pochodzącym od dawców na różnych etapach zakażenia. Próbki pochodziły z terytorium całego kraju. Badania genomu HBV obejmowały określenie genotypu oraz analizę specyficznych mutacji. Genotypy parvowirusa B19 badano u objawowo zakażonych pacjentów. Szczegółowo opisano przebieg zakażenia genotypami innymi niż klasyczny genotyp 1.
Materiał i metody: Dawcy zakażeni HBV zostali zidentyfikowani w trakcie rutynowych badań przeglądowych antygenu powierzchniowego (HBsAg) oraz DNA HBV. W celu dokładnego określenia typu zakażenia oraz charakterystyki wirusologicznej badano u nich także inne markery zakażenia (antygen HBe, przeciwciała anty-HBc, anty-HBs oraz anty-HBe), oceniano ilość DNA HBV oraz, w przypadku obecności antygenu HBs, określano jego stężenie. Analizy polimorfizmu HBV dokonano w 7 próbkach pochodzących od dawców we wczesnej fazie zakażenia, w 170 próbkach od dawców z HBsAg oraz w 40 próbkach z tzw. „ukrytym” zakażeniem HBV (OBI). Genotypy HBV określano przez sekwencjonowanie, a następnie analizę filogenetyczną lub przez analizę sekwencji regionu pre-S/S za pomocą programu BLAST/genotyping. Analizie filogenetycznej poddano całe genomy (n = 53) lub sekwencje specyficznych regionów: pre-S/S oraz basic core promoter/ /pre-core (BCP/PC) (odpowiednio 91 i 154 próbki) dawców z HBsAg. Pacjentów zakażonych B19V identyfikowano metodą real-time PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym), która wykrywa wszystkie trzy genotypy B19V. Spośród 69 DNA B19V dodatnich pacjentów z klinik hematologicznych oraz ginekologiczno-położniczych zdiagnozowanych w latach 2004-2008 do analizy polimorfizmu wybrano 30, przede wszystkim w ostrej fazie infekcji. Badanie genotypów przeprowadzono stosując analizę sekwencji regionu NS1/VP1u. U osób zakażonych genotypem innym niż 1 zbierano kolejne próbki, analizując w nich parametry morfologii krwi obwodowej oraz wirusologiczne markery zakażenia (anty-B19V oraz DNA B19V).
Wyniki: Mediana wieku dawców zakażonych HBV na wczesnym etapie zakażenia wynosiła 40 lat, nie wykrywano u nich HBsAg, a jedynie DNA HBV (mediana 10,12 IU/ml, maksymalnie 140 IU/ml), u jednej osoby wykryto dodatkowo anty-HBs, anty-HBc klasy IgM oraz anty-HBe. Dawcy z HBsAg byli młodsi (mediana wieku 21 lat). Anty-HBs, anty-HBe oraz HBeAg wykryto odpowiednio u 5%; 92,4% oraz 10,5% dawców tej grupy. Stężenie DNA HBV wahało się między ilością niemierzalną a 3,1 × 1010 IU/ml (mediana: 4,10 × 103 IU/ml). Dawcy z OBI byli najstarsi (mediana 47 lat), wszyscy byli z anty-HBc, u 7 dawców (18,9%) wykryto niskie stężenie anty-HBs (mediana 1,45 IU/L), u żadnego z badanych nie stwierdzono HBeAg, natomiast u 8 wykryto przeciwciała do tego antygenu (38,1%).
U polskich krwiodawców zakażonych HBV identyfikowano zakażenie trzema genotypami — A, D oraz H. Dwa pierwsze genotypy wykrywano na wszystkich trzech etapach zakażenia, genotyp H wykryto jedynie u dwóch dawców z OBI. Rozkład częstości genotypów A i D był odmienny u dawców z HBsAg i OBI. W pierwszej z wymienionych grup dominował genotyp A2 (80,5%), prawie czterokrotnie rzadziej wśród zakażonych identyfikowano genotyp D (19,5%). U osób z OBI dominował genotyp D (57,5% zakażonych), genotyp A wykrywano jedynie u 37,5% badanych. Szczegółowa analiza regionu MHR genu S u osób na wczesnym etapie zakażenia wykazała zakażenia jedynie forma dziką, u dawców na późniejszym etapie zakażenia obserwowano narastający polimorfizm na poziomie sekwencji aminokwasowych. Częstość nosicieli mutacji prowadzących do substytucji aminokwasowych w regionie MHR wynosiła odpowiednio 17,6% oraz 52,5% dawców z HBsAg oraz z OBI. Częstość nosicielstwa tego typu mutacji była większa u dawców zakażonych genotypem D niż genotypem A, zarówno u dawców z HBsAg, jak i tych z OBI. Zidentyfikowano mutacje ucieczki prowadzące do substytucji aminokwasowych utrudniających rozpoznanie HBsAg przez przeciwciała w trakcie diagnostyki metodami serologicznymi. Szczegółowa analiza filogenetyczna całych genomów pochodzących od dawców z HBsAg wykazała zakażenia podtypami A2 oraz D1 i D2. Mediana współczynnika HBsAg/HBV DNA wyrażona w IU/ml wynosiła około 1 dla obu genotypów, przy czym skrajnie niskie i skrajnie wysokie wartości obserwowano częściej dla genotypu D. Analiza regionu BCP/PC u dawców z HBsAg wykazała występowanie podwójnych mutacji 1762T/ /1764A w 49/125 (39,2%) sekwencji genotypu A2 oraz 6/29 (20,7%) genotypu D (p = 0,08). Mutacje w regionach pre-C i BCP nie korelowały ani z poziomem HBsAg, ani DNA HBV.
Analiza polimorfizmu B19V wykazała, że większość pacjentów z B19V była zakażonych genotypem 1. U dwóch osób (6,6%), u biorczyni przeszczepu nerki z ciężką anemią oraz u chorej na białaczkę z pancytopenią w następstwie chemioterapii, zidentyfikowano zakażenie genotypem 2. W obu przypadkach zakażenie związane było z wysoką wiremią. Normalizację stanu klinicznego oraz spadek poziomu DNA B19V obserwowano u pierwszej pacjentki po zmianie leczenia immunosupresyjnego, u drugiej zaś po dożylnym podaniu immunoglobulin. Pomimo poprawy parametrów klinicznych oraz wirusologicznych, DNA B19V DNA wykrywano przez cały czas prowadzenia obserwacji. W późniejszym okresie biorczyni przeszczepu nerki zaszła w ciążę, jednak mimo przewlekłej infekcji genotypem 2 B19V nie obserwowano u niej żadnych objawów klinicznych.
Wnioski: Dobór testów diagnostycznych, ich walidacja oraz inne formy kontroli jakości badań HBV i B19V, prowadzone zarówno u krwiodawców, jak i chorych, powinny uwzględniać, oprócz najpowszechniej występujących u osób zakażonych genotypów A HBV oraz genotypu 1 B19V, także genotypy występujące rzadziej; odpowiednio, D i H oraz genotyp 2. Obecne badania nie potwierdzają całkowitego zaniku genotypu 2 B19V w Polsce, natomiast są zgodne z wcześniejszymi informacjami o występowaniu zakażenia genotypem H HBV w naszym kraju. Przebieg zakażenia genotypem 2 u chorych leczonych immunosupresyjnie jest podobny jak w przypadku zakażenia genotypem 1 B19V. U osób z genotypem D HBV stwierdzono większy, niż w przypadku genotypu A, polimorfizm w regionie kodującym epitopy kluczowe dla wiązania antygenu HBs przez przeciwciała (neutralizujące), co ma potencjalne znaczenie dla prawidłowości diagnostyki metodami serologicznymi oraz dla skuteczności profilaktyki wykorzystującej szczepienia ochronne oraz immunoglobuliny anty-HBs.
J. Transf. Med. 2011; 2: 45–81

Słowa kluczowe: wirus zapalenia wątroby typu BHBVparvowirus B19B19Vgenotypymutantyepidemiologiadawcy krwi