Zgodność wyników badań w kierunku Chlamydia trachomatis metodą immunofluorescencji bezpośredniej, ELISA i PCR z uwzględnieniem ich czułości i swoistości, u pacjentów z NGU

Irena Choroszy-Król; Magdalena Frej-Mądrzak; Anna Trojgo; Agnieszka Jama-Kmiecik; Dorota Teryks-Wołyniec; Jolanta Sarowska

WYBRANE PROBLEMY KLINICZNE

Irena Choroszy-Król, Magdalena Frej-Mądrzak, Anna Trojgo, Agnieszka Jama-Kmiecik, Dorota Teryks-Wołyniec, Jolanta Sarowska

Zakład Nauk Podstawowych WNOZ Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu

Zgodność wyników badań w kierunku Chlamydia trachomatis metodą immunofluorescencji bezpośredniej, ELISA i PCR z uwzględnieniem ich czułości i swoistości, u pacjentów z NGU

The consistency of tests results for Chlamydia trachomatis carried out by direct immunofluorescence test, ELISA and PCR including their sensitivity and specificity in patients with NGU

STRESZCZENIE

Wstęp. Analizę zgodności wyników badań w kierunku Chlamydia trachomatis (Ct) wykonano trzema metodami: techniką immunofluorescencji bezpośredniej (IF), nested-PCR oraz metodą immunoenzymatyczną.

Materiał i metody. Grupę badaną stanowili pacjenci hospitalizowani na Oddziale Nefrologii Pediatrycznej oraz z przychodni MicroFAM (n = 61) w wieku 3–76 lat. Przedmiotem badań były wymazy z cewki moczowej, surowica krwi oraz mocz. Antygen Ct wykrywano techniką IF. Do wykrywania genu crp użyto techniki nested-PCR. Obecność swoistych przeciwciał anty-cHSP60 zbadano metodą ELISA.

Wyniki. Analiza wyników badań w kierunku Ct otrzymanych trzema wymienionymi metodami wykazała zgodność w 62,3%. Swoiste przeciwciała anty-cHSP60 w surowicy krwi metodą ELISA wykrywano równie często jak obecność antygenu Ct metodą IF (16,4%). Nieco rzadziej wykrywano obecność genu crp w moczu techniką nested-PCR (14,8%).

Wnioski. Biorąc pod uwagę czułość i swoistość trzech zastosowanych testów oraz aspekt ekonomiczny, wskazane jest wykonywanie badań w kierunku Ct testem IF z uwagi na prostotę wykonania i niższy koszt badania.

Forum Medycyny Rodzinnej 2016, tom 10, nr 2, 91–94

słowa kluczowe: diagnostyka, wymazy z cewki, nested-PCR

ABSTRACT

Background. The analysis of consistency of research results for Ct conducted by three diagnostic methods: direct immunofluorescence, nested PCR and immunoenzymatic technique.

Material and methods. Studied group — patients hospitalized at the Department and Clinic of Paediatric Nephrology and patients from outpatient clinic MicroFAM (n = 61) aged 3–76. Material for research were urethral swabs, serum and urine. Ct antigen was detected using direct immunofluorescence method, C. trachomatis crp gene was found by nested PCR technique. Specific anty-cHSP60 antibodies were detected using ELISA method.

Results. The analysis of the results of research for Ct conducted by three diagnostic methods showed the compatibility in 62,3%. Specific anty-cHSP60 antibodies were detected in serum by ELISA method as often as Ct antigen by IF (16,4%). Less often Ct crp gene was found in urine by nested-PCR technique (14,8%).

Conclusions. Considering the sensitivity and specificity of three tests and economic aspect, it’s advisable to perform the studies for Ct by IF method due to simplicity of performance and lower cost of the study.

Forum Medycyny Rodzinnej 2016, vol 10, no 2, 91–94

key words: diagnosis, urethral swabs, nested-PCR

WSTĘP

Do nowoczesnych metod diagnostyki Ct zalicza się techniki amplifikacji kwasów nukleinowych, w tym polimerazową reakcję łańcuchową (PCR, polymerase chain reaction) i ligazową reakcję łańcuchową (LCR, ligase chain reaction) [1–3]. Techniki te, jakkolwiek wysoce czułe i swoiste, wymagają drogiego zestawu aparatury i odczynników do badań, dlatego też mogą być stosowane tylko w nielicznych laboratoriach. Celem pracy była ocena zgodności wyników badań w kierunku Ct przy zastosowaniu wyżej wymienionych metod, ze szczególnym uwzględnieniem ich czułości i swoistości.

MATERIAŁ I METODY

Badaniom w kierunku zakażenia Ct poddano 61 pacjentów, w tym 36 mężczyzn i 19 kobiet w wieku 18–76 lat, a także 6 dzieci w wieku 3–17 lat. Materiałem do badań były wymazy z cewki moczowej, mocz oraz surowica krwi pochodzące od pacjentów Oddziału Nefrologii Pediatrycznej oraz Przychodni MicroFam z objawami stanów zapalnych cewki moczowej. Wymazy z cewki moczowej pobierano przy użyciu sterylnych, jednorazowych, bawełnianych wymazówek. Mocz pobrano rano, bez zastosowania higieny osobistej, w ilości około 10 ml do jałowego pojemnika. W badaniach własnych użyto metodę IF (test Pathfinder® Chlamydia trachomatis Direct Specimen firmy BioRad) do wykrywania antygenu wymienionych bakterii [4]. Metodą nested-PCR (test PCR — Chlamydia trachomatis firmy DNA Gdańsk), wykrywano gen crp [5], natomiast metodą ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) stwierdzano obecność przeciwciał anty-cHSP60 (test ELISA firmy Medac) [6]. Wszystkie badania wykonano zgodnie z instrukcją producentów.

WYNIKI

Zgodność wyników uzyskanych 3 metodami diagnostycznymi przedstawiono w tabeli 1, z której wynika, że u 38/61 (62,3%) badanych uzyskano wyniki zgodne. U jednego pacjenta wynik dodatni uzyskano wszystkimi metodami, co stanowi 1,6%, u pozostałych pacjentów (60,7%) uzyskano wyniki ujemne. Wyniki niezgodne stwierdzono u 23/61 pacjentów, co stanowi 37,7%. U 2/19 kobiet (10,5%) otrzymano wynik dodatni wyłącznie metodą ELISA, a u 3/19 kobiet (15,8%) wynik dodatni uzyskano tylko techniką nested-PCR. Z kolei u 7/36 mężczyzn (19,4%) uzyskano wynik dodatni jedynie metodą IF, u 6/36 mężczyzn (16,7%) wynik dodatni jedynie metodą ELISA, a u 3/36 mężczyzn (8,3%) wynik dodatni tylko techniką nested-PCR. U jednego mężczyzny (2,8%) otrzymano wynik dodatni dwoma wymienionymi metodami. W grupie dzieci wynik dodatni uzyskano tylko u jednej dziewczynki (16,7%), dwiema metodami — IF oraz techniką nested-PCR (tab. 2). Porównując czułość i swoistość metody ELISA oraz techniki nested-PCR z metodą IF, stwierdzono, że obie metody mają wysoką swoistość (odpowiednio: ELISA — 84,3%, nested-PCR — 88,2% ) oraz bardzo niską czułość (ELISA — 10,0% , nested-PCR — 30,0% ) (tab. 2, 3).

Tabela 1
Zgodność wyników uzyskanych trzema metodami diagnostycznymi (DIF, ELISA, PCR)
Płeć	Liczba badanych	Zgodnie dodatni (IF+, ELISA+, PCR+)		Zgodnie ujemny (IF–, ELISA–, PCR–)
Płeć	Liczba badanych	Liczba	(%)	Liczba	(%)
Kobiety	19	0	0,0	13	68,4
Mężczyźni	36	1	2,8	19	52,8
Dzieci	6	0	0,0	5	83,3
Ogółem	61	1	1,6	37	60,7

Tabela 2
Niezgodność wyników w kierunku Chlamydia trachomatis uzyskanych wszystkimi metodami diagnostycznymi (DIF, ELISA, PCR)
Płeć	Liczba badanych	Wyniki
Płeć	Liczba badanych	IF+ ELISA– (IgG anty-cHSP60) PCR–	IF+ ELISA+ (IgG anty-cHSP60) PCR–	IF+ ELISA– (IgG anty-cHSP60) PCR+	IF– ELISA+ (IgG anty-cHSP60) PCR–	IF– ELISA– (IgG anty-cHSP60) PCR+	IF– ELISA+ (IgG anty-cHSP60) PCR+
Kobiety	19	0 (0,0%)	0 (0,0%)	0 (0,0%)	2 (10,5%)	3 (15,8%)	0 (0,0%)
Mężczyźni	36	7 (19,4%	0 (0,0%)	1 (2,8%)	6 (16,7%)	3 (8,3%)	0 (0,0%)
Dzieci	6	0 (0,0%)	0 (0,0%)	1 (16,7%)	0 (0,0%)	0 (0,0%)	0 (0,0%)
Ogółem	61	7 (11,5%)	0 (0,0%)	2 (3,3%)	8 (13,1%)	6 (9,8%)	0 (0,0%)

Tabela 3
Porównanie czułości i swoistości metody immunoenzymatycznej (ELISA) z metodą immunofluo-rescencji bezpośredniej (DIF)
		DIF
		+	–
ELISA (IgG anty-cHSP60)	+	1	8
ELISA (IgG anty-cHSP60)	–	9	43

Czułość: 1/10 = 10,0%
Swoistość: 43/51 = 84,3%

Tabela 4
Porównanie czułości i swoistości metody *nested*-PCR z metodą immu-nofluorescencji bezpośredniej (DIF)
		DIF
		+	–
*nested*-PCR	+	3	6
	–	7	45

Czułość: 3/10 = 30,0%
Swoistość: 45/51 = 88,2%

DYSKUSJA

W badaniach własnych porównano częstość występowania antygenu Ct, genu crp oraz przeciwciał anty-cHSP60 u pacjentów z NGU. Od 61 pacjentów, w tym 36 mężczyzn, 19 kobiet oraz 6 dzieci, pobrano wymaz z cewki moczowej, mocz oraz surowicę krwi. U 25,0% mężczyzn oraz 16,7% dzieci wykryto antygen Ct w wymazach z cewki moczowej metodą IF-bezpośredniej. U kobiet nie wykryto antygenu Ct w wymazach z cewki moczowej. Swoiste przeciwciała anty-cHSP60 stwierdzono w surowicy krwi 22,2% mężczyzn oraz 10,5% kobiet. U dzieci nie stwierdzono obecności przeciwciał anty-cHSP60 w surowicy krwi. Do wykrywania przeciwciał anty-cHSP60 zastosowano test ELISA. Techniką nested-PCR wykryto gen crp w moczu u 13,9% mężczyzn, u 15,8% kobiet oraz u 16,7% dzieci. W badaniach własnych nie stwierdzono zgodności wykrywania przeciwciał anty-cHSP60 w surowicy krwi, z obecnością genu crp w moczu u pacjentów z NGU. Zaobserwowano stosunkowo niską czułość porównywanych metod diagnostycznych przy jednoczesnej dobrej swoistości. Przyczyną tak niskiej czułości obu wymienionych metod może być brak standaryzacji obu metod diagnostycznych oraz używanie przez firmy produkujące odczynniki do techniki PCR różnych primerów. Natomiast niska czułość techniki ELISA może wynikać z użycia LPS jako antygenu do identyfikacji przeciwciał, który może reagować krzyżowo z antygenami innych drobnoustrojów, dając niemiarodajne wyniki [7].

WNIOSKI

Metoda ELISA, charakteryzująca się bardzo niską czułością, nie może być stosowana jako metoda diagnostyczna w kierunku rozpoznania NGU o etiologii chlamydialnej.
Biorąc pod uwagę czułość i swoistość trzech zastosowanych testów oraz aspekt ekonomiczny, wskazane jest wykonywanie badań w kierunku Ct testem IF z uwagi na prostotę wykonania i niższy koszt badania.

Adres do korespondencji:

prof. dr hab. n. med. Irena Choroszy-Król

Zakład Nauk Podstawowych

ul. Chałubińskiego 4, 50–368 Wrocław

tel.: (071) 784–00–76

e-mail: irena.choroszy-krol@umed.wroc.pl

PIŚMIENNICTWO

Frej-Mądrzak M., Teryks-Wołyniec D., Elias M., Choroszy-Król I. Znaczenie diagnostyczne wykrywania genu crp Chlamydia trachomatis oraz przeciwciał anty-cHSP60 u niepłodnych kobiet. Fam. Med. Prim. Care Rev. 2010; 12: 176–178.
Hjelholt A., Christiansen G., Johannesson T.G. i wsp. Tubal factor infertility is associated with antibodies against Chlamydia trachomatis heat shock protein 60 (HSP60) but not human HSP60. Hum. Reprod. 2011; 26: 2069–2076.
Choroszy-Król I., Ruczkowska J. Laboratoryjna diagnostyka chlamydioz. Wydawnictwo AM, Wrocław 2004.
Direct Antigen Detection System for the Identification of Chlamydia trachomatis in Direct Specimens. BioRad Pathfinder® Chlamydia trachomatis Direct Specimen. 2003.
Zestaw diagnostyczny PCR — Chlamydia trachomatis do wykrywania Chlamydia trachomatis w moczu lub w kulturach komórkowych. DNA — Gdańsk II s.c.
cHSP60-IgG-ELISA medac. Recombinant enzyme immunoassay for the quantitative detection of IgG antibodies to chlamydial heat shock protein 60. Medac 2008.
Choroszy-Król I., Frej-Mądrzak M., Teryks-Wołyniec D. Zakażenia układu moczowo-płciowego wywoływane przez Chlamydia trachomatis w praktyce lekarza rodzinnego. Fam. Med. Prim. Care Rev. 2011; 13: 292–295.