Edyta Cichocka, Janusz Gumprecht

Katedra Chorób Wewnętrznych, Diabetologii i Nefrologii, Wydział Lekarski z Oddziałem Lekarsko-Dentystycznym w Zabrzu, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach

Czy tylko HbA_1c? Alternatywne biomarkery do oceny wyrównania glikemii

Is HbA_1c the only choice? Alternative biomarkers for glycaemic control assessment

STRESZCZENIE

U chorych na cukrzycę rośnie stężenie białek glikowanych, spośród których najistotniejszym parametrem, „złotym standardem” kontroli glikemii jest hemoglobina glikowana (HbA_1c). Glikacji ulegają również inne białka osocza, między innymi albuminy i immunoglobuliny. W praktyce wykorzystuje się fruktozaminę oraz glikowaną albuminę. Istnieją jednak stany chorobowe, które wpływają na stężenie HbA_1c, dlatego też poszukuje się alternatywnych biomarkerów do monitorowania glikemii. Najbardziej obiecująca wydaje się glikowana albumina (GA), której oznaczenie pozwala na szybsze wychwycenie zmian wyrównania glikemii w przypadku pogorszenia kontroli metabolicznej, a także na udokumentowanie poprawy wyrównania po wprowadzeniu odpowiedniego leczenia. Może to mieć przede wszystkim znaczenie dla chorych oczekujących na zabiegi kardiochirurgiczne, chirurgiczne czy ortopedyczne, które z powodu nieadekwatnej kontroli glikemii bywają odroczone. Monitorowanie GA zamiast HbA_1c w szczególnych grupach pacjentów (m.in.: chore w ciąży, pacjenci z niewydolnością nerek, ze schorzeniami hematologicznymi) odzwierciedla stopień wyrównania metabolicznego cukrzycy lepiej niż wskaźnik HbA_1c.

Słowa kluczowe: cukrzyca, HbA_1c, glikowana albumina

ABSTRACT

A rise in concentrations of glycated proteins occurs in diabetic patients; glycated hemoglobin is the most significant parameter, a ‘gold standard’ for glycaemic control. Other serum proteins also become glycated, i.a albumins and immunoglobulins. In practice, Fructosamine and glycated albumin are used. However, some conditions influence HbA_1c concentrations, hence the search for alternative biomarkers for glycaemia monitoring. Glycated albumin (GA) appears to be the most promising, as its assessment enables both faster detection of changes in glycaemia control in cases of poor metabolic discipline and documentation of glyceamic control improvement, after appropriate treatment is implemented. This may be important mostly in patients scheduled for surgical, cardiosurgical or orthopedic procedures, which are sometimes postponed because of inadequate glycaemia control. Monitoring GA in particular groups of patients (i.a during pregnancy, with renal insufficiency or haematologic comorbidities) reflects glycaemic control levels more accurately than HbA_1c.

Key words: diabetes, HbA_1c, glycated albumin

Wstęp

Pomimo ogromnego postępu medycyny, jaki dokonał się w ciągu ostatnich lat, leczenie cukrzycy nadal pozostaje dużym wyzwaniem. Dążenie do normalizacji glikemii ma kluczowe znaczenie w zapobieganiu i hamowaniu postępu przewlekłych powikłań cukrzycy, zarówno o typie makro-, jak i mikronaczyniowym. Nieodłącznym elementem efektywnej, wielokierunkowej terapii cukrzycy pozostaje samokontrola, której istotną składową jest monitorowanie przez chorego stężenia glukozy we krwi. Zgodnie z zaleceniami oznaczanie glikemii w ramach samokontroli należy rozpocząć bezzwłocznie w chwili rozpoznania cukrzycy w celu lepszego zrozumienia choroby oraz zapobiegania przypadkom zarówno hipoglikemii, jak i hiperglikemii, a co za tym idzie – zapobiegania ostrym i przewlekłym powikłaniom cukrzycy.

Monitorowanie glikemii powinno być elementem edukacji i środkiem dostosowania terapii do wyznaczonych optymalnych celów. Samokontrola powinna pozwolić na efektywne uczestnictwo w kontroli i leczeniu choroby, modyfikację zachowań zdrowotnych czy też dokonanie wspólnie z lekarzem zmian w stosowanym schemacie terapeutycznym. Schemat samokontroli zależy od rodzaju stosowanej terapii i ustalany jest indywidualnie przez prowadzącego diabetologa. U chorych na cukrzycę, w odróżnieniu od populacji bez cukrzycy, rośnie stężenie białek glikowanych, spośród których najistotniejszym parametrem wykorzystywanym w codziennej praktyce klinicznej, „złotym standardem” kontroli glikemii jest hemoglobina glikowana (HbA_1c).

Hemoglobina glikowana (HbA_1c)

Hemoglobina glikowana jest miarą stopnia glikacji hemoglobiny w erytrocytach, wyrażaną jako procent całkowitego stężenia hemoglobiny. Odzwierciedla ona ekspozycję erytrocytów na nieodwracalne działanie glukozy, z efektem zależnym od czasu trwania i stężenia. Ponieważ u chorych na cukrzycę stężenie glukozy we krwi zmienia się w szerokim zakresie w czasie doby oraz w poszczególnych dniach, stężenie HbA_1c jest najlepszym wskaźnikiem oceny długoterminowej kontroli glikemii. Hemoglobina glikowana powstaje w procesie nieenzymatycznej glikacji wskutek przyłączenia cząsteczki glukozy do N-końcowej grupy aminowej łańcucha β hemoglobiny. Błona erytrocytu jest przepuszczalna dla glukozy, zatem ilość zawartej w nim hemoglobiny glikowanej odzwierciedla średnie stężenie glukozy we krwi w ciągu średniego czasu życia erytrocytu (2–3 miesiące). Glikacja jest procesem nieodwracalnym, stąd glukoza związana z hemoglobiną pozostaje w erytrocycie do końca życia krwinki. Stężenie HbA_1c we krwi jest proporcjonalne do długości życia erytrocyta i stężenia glukozy we krwi, jednak 50% puli odzwierciedla glikemię z miesiąca poprzedzającego badanie, a okres między 60. a 120. dniem jest reprezentowany przez 25% puli HbA_1c [1–3]. Gwałtowny wzrost glikemii wpływa na szybkie zmiany HbA_1c w ciągu pierwszych dwóch miesięcy, z następującą później stabilizacją. Metodą referencyjną oznaczania HbA_1c jest wysokosprawna chromatografia cieczowa zatwierdzona przez National Glycohemoglobin Standarization Program (NGSP; Narodowy Program Standaryzacji Hemoglobiny Glikowanej) w Stanach Zjednoczonych [4, 5]. Wynik podawany jest jako procent HbA_1c w stosunku do całkowitego stężenia hemoglobiny. Zaleca się, aby metody oznaczania hemoglobiny glikowanej były certyfikowane przez NGSP. Mimo stosowania oznaczeń HbA_1c do rozpoznawania cukrzycy, między innymi w Stanach Zjednoczonych, w Polsce wykorzystuje się jej oznaczenie jedynie do monitorowania wyrównania glikemii (zalecenia Polskiego Towarzystwa Diabetologicznego) [6].

Oznaczenie HbA_1c, wykorzystywane w diabetologii od 1976 roku [7], ma jednak pewne ograniczenia wynikające z różnic płciowych, rasowych i etnicznych. Po uwzględnieniu wieku i wskaźnika masy ciała (BMI, body mass index) wykazano wyższe wartości HbA_1c u czarnoskórych mężczyzn (o 0,3%) i kobiet (o 0,4%) w porównaniu z białymi mężczyznami i kobietami bez cukrzycy (p < 0,05) [8]. Dodatkowe badania porównujące stężenie HbA_1c między rasowymi i etnicznymi grupami chorych na cukrzycę typu 2 wykazywały wyższe stężenie HbA_1c u Amerykanów pochodzenia afrykańskiego, Latynosów i Azjatów/mieszkańców wysp Pacyfiku w porównaniu z chorymi rasy białej [9]. Zastosowanie wielokrotnej regresji liniowej w celu uwzględnienia czynników, które mogą mieć wpływ na glikemię, takich jak: wiek, płeć, wykształcenie, stan cywilny, otyłość (BMI i obwód talii), ciśnienie tętnicze, glikemia na czczo i po obciążeniu glukozą, funkcja komórki β, insulinooporność i stężenie hematokrytu, pozwoliło stwierdzić, że odsetek HbA_1c był istotnie wyższy wśród Amerykanów pochodzenia afrykańskiego, Latynosów, Indian i Amerykanów pochodzenia azjatyckiego w stosunku do chorych rasy białej [10].

Fałszywie podwyższone wartości HbA_1c uzyskuje się również u pacjentów z niedokrwistością z niedoboru witaminy B₁₂ i kwasu foliowego, a także z niedoboru żelaza, w przewlekłej niewydolności nerek, hiperbilirubinemii, u chorych stosujących duże dawki kwasu acetylosalicylowego, przyjmujących opiaty, po splenektomii, a także w przypadku wad erytrocytów (obniżone pH erytrocytów, wydłużenie przeżycia erytrocytów) [11–16]. Z kolei fałszywie zaniżone wyniki uzyskuje się u pacjentów leczonych preparatami żelaza, witaminą B₁₂, kwasem foliowym, erytropoetyną, witaminą C i E, jak również w stanach skróconego przeżycia erytrocytów (duża utrata krwi, niedokrwistość hemolityczna), hemoglobinopatiach, splenomegalii, przewlekłych chorobach wątroby, u osób nadużywających alkoholu, w hipertriglicerydemii, w reumatoidalnym zapaleniu stawów oraz podczas stosowania leków antyretrowirusowych [11–16].

Hemoglobina płodowa (HbF) jest główną hemoglobiną podczas życia wewnątrzmacicznego; w momencie urodzenia jej stężenie waha się w przedziale 60–95%. W czasie pierwszego roku życia odsetek HbF spada do wartości zbliżonych u osób dorosłych i wynosi około 1%. Podwyższone stężenie HbF może wystąpić w przebiegu stanów patologicznych (np. białaczki, niedokrwistości, talasemii) lub wrodzonego przetrwałego podwyższonego stężenia HbF [17], kiedy to jej poziom może sięgać nawet 30%. Schorzenie to przebiega bezobjawowo, a jego obecność może wpływać na oznaczenie HbA_1c. Podwyższone stężenie HbF, w zależności od metody wykorzystanej do oznaczenia, może fałszywie zaniżać wynik HbA_1c lub nie wpływać na jej oznaczenie [18]. Ponadto, ze względu na obecność HbF, u dzieci chorych na cukrzycę noworodkową HbA_1c nie jest dobrym markerem wyrównania glikemii [19].

Fałszywie obniżone wartości HbA_1c mogą występować u chorych na cukrzycę z zaburzeniami czynności nerek, co jest uzależnione od skrócenia przeżycia erytrocytów, zastosowania rekombinowanej ludzkiej erytropoetyny czy leczenia preparatami żelaza. Samo środowisko mocznicowe, zmiana pH krwi czy obecność karbamylowanej Hb, a także konieczność przetoczenia krwi u chorego z ciężką niewydolnością nerek powodują obniżenie stężenia HbA_1c, niezależnie od zmian glikemii [20–23].

Glikacja białek osocza

U chorych na cukrzycę glikacji ulegają również inne białka osocza, między innymi albuminy i immunoglobuliny. W praktyce wykorzystuje się fruktozaminę oraz glikowaną albuminę.

Fruktozamina (izoglukozamina)

Fruktozamina powstaje w procesie nieenzymatycznej glikacji grupy karbonylowej glukozy z grupami aminowymi krążących białek osocza, głównie albumin. Ze względu na krótszy czas półtrwania białek osocza w porównania z okresem przeżycia erytrocytów stężenie fruktozaminy jest markerem krótkoterminowym i pozwala na retrospektywną ocenę stężenia glukozy w okresie 10–14 dni, a według niektórych autorów do 21 dni poprzedzających pobranie próbki krwi [24]. Stanowi ona alternatywę w przypadkach, gdy oznaczenie HbA_1c jest niewiarygodne. Jest także przydatne w monitorowaniu cukrzycy ciężarnych, gdyż pozwala na ocenę szybkości zmian glikemii i wyrównania cukrzycy w krótkim czasie. Fruktozamina nie jest jednak markerem idealnym – na jej stężenie wpływają stany chorobowe zmieniające stężenie białek osocza, dysproteinemie. Fałszywie zaniżone stężenie fruktozaminy może być związane z obniżonym stężeniem białka i/lub albuminy lub wynikać ze zwiększonej utraty białek z moczem (np. zespół nerczycowy) czy też nieprawidłowości wchłaniania w przewodzie pokarmowym (np. zespoły złego wchłaniania), a także ze zmian wytwarzania białek (m.in. marskość wątroby) [25]. Badania nie należy wykonywać, gdy stężenie albumin w surowicy jest mniejsze niż 30 g/l. Oznaczenie fruktozaminy jest stosowane w praktyce dużo rzadziej niż oznaczenie HbA_1c ze względu na jego niską czułość, która zależy od składu białek krwi i ich przemian, nawodnienia, stężenia bilirubiny w surowicy krwi czy hemolizy) [26].

W badaniach przeprowadzonych wśród pacjentów z przewlekłą chorobą nerek (stadium 3. i 4.) wykazano związek między stężeniem fruktozaminy i dobrą kontrolą glikemii u chorych na cukrzycę typu 2, jednak szacowane średnie stężenie glukozy oceniane na podstawie stężenia fruktozaminy było znacznie zaniżone [27]. W innych badaniach, obejmujących chorych hemodializowanych, oznaczenie frukotozaminy, skorygowane o aktualne stężenie albumin w surowicy krwi, korelowało, podobnie jak HbA_1c, ze stopniem wyrównania glikemii [28].

Glikowana albumina (GA)

Glikowana albumina stanowi odsetek całkowitej zawartości albumin w surowicy krwi. Albumina jest najbardziej podatnym na glikację białkiem osocza. Glikowana albumina jest podobną do fruktozaminy ketoaminą, która powstaje przez wiązanie glukozy i albuminy w nieenzymatycznej reakcji oksydacji. Ze względu na krótki okres półtrwania albumin (ok. 15 dni) GA odzwierciedla krótki okres wyrównania glikemii (2–3 tygodnie) [29]. Jej stężenie nie zależy od całkowitego stężenia albumin i jest blisko 3-krotnie wyższe niż odsetek HbA_1c. Wynik wylicza się na podstawie stosunku GA/albuminy. Glikacja powoduje obniżenie właściwości antyoksydacyjnych albuminy i zmniejsza jej właściwości wiążące, co może wpływać niekorzystnie na stężenie w surowicy stosowanych leków [30]. Wzrost stężenia GA, podobnie jak końcowych produktów zaawansowanej glikacji (AGE, advanced glycation end-products), wpływa na zmianę szlaków sygnalizacyjnych komórek i aktywuje mediatory zapalne, biorące udział w rozwoju późnych powikłań cukrzycy. Glikowana albumina wiąże się ze specyficznymi białkami śródbłonka naczyń, indukując tym samym rozwój późnych powikłań [30].

Glikowana albumina pozostaje poza wpływem nieprawidłowości dotyczących erytrocytów czy hemoglobinopatii. Jej stężenie jest szczególnie użyteczne w ocenie kontroli glikemii u pacjentów ze schorzeniami takimi jak: niedokrwistość, krwawienia, niewydolność nerek, ciąża, marskość wątroby, cukrzyca noworodków, jak również u pacjentów ze schorzeniami, w których glikemia szybko się zmienia, także w chwiejnej cukrzycy typu 1. W porównaniu z HbA_1c GA lepiej koreluje z glikemią poposiłkową i z dziennymi fluktuacjami glukozy, odzwierciedlając krótki okres wyrównania glikemii [31].

Glikowaną albuminę oznacza się metodą kolorymetryczną, enzymatyczną, immunologiczną, chromatograficznie i elektrochemicznie [32]. Najczęściej wykorzystywanym w praktyce klinicznej sposobem jest metoda enzymatyczna. Od niedawna stosuje się test komercyjny Luccica GA-L (Asahi Kasei Pharma) z użyciem analizatora biochemicznego [33]. Zakres referencyjny dla glikowanej albuminy wynosi 11,9–15,8%. Określono go na podstawie badań przeprowadzonych wśród osób bez stwierdzonej cukrzycy i z prawidłowym wynikiem doustnego testu obciążenia glukozy (populacje amerykańska, japońska i włoska) [33]. Nie zaobserwowano różnic zależnych od płci, ale u osób rasy czarnej wartości były wyższe [33].

Kliniczne znaczenie GA

W badaniu przeprowadzonym wśród chorych na świeżo rozpoznaną cukrzycę typu 2, u których zastosowano intensywną insulinoterapię przez 8 tygodni, wykazano nieznaczne obniżenie wskaźnika HbA_1c (z 10,9% do 10,0%), podczas gdy stężenie GA obniżyło się z wartości 35,5% do 25,0%. Glikowana albumina wydaje się zatem bardziej odpowiednim wskaźnikiem do oceny efektywności zmiany leczenia w krótkim czasie. Jednocześnie wzrost stężenia GA dużo szybciej niż HbA_1c dostarcza informacji o pogarszającej się kontroli glikemii [34].

Istnieją dane sugerujące, że GA jest wskaźnikiem zależnym od glikemii poposiłkowej w większym stopniu niż wartość HbA_1c, która odzwierciedla średnią glikemię z określonego przedziału czasowego [35]. Do użytku wprowadzono również wskaźnik GA/HbA_1c, który określono jako wykładnik upośledzonego wydzielania insuliny, a nie insulinooporności. Podwyższony wskaźnik GA/HbA_1c może być wynikiem pogarszającej się funkcji komórki β u chorych na cukrzycę typu 2. Porównując wartość wskaźnika GA/HbA_1c u chorych na cukrzycę typu 2 leczonych insuliną i doustnymi lekami hipoglikemizującymi, uzyskano wyższe wartości w grupie stosującej insulinę [36]. Ponadto, dowiedziono, że wskaźnik GA/HbA_1c jest istotnie wyższy u chorych z podobnymi wartościami HbA_1c, lecz z większymi wahaniami glikemii [35].

U kobiet w ciąży, które chorują na cukrzycę przedciążową bądź u których rozwija się cukrzyca ciężarnych, intensywna kontrola glikemii jest szczególnie istotna. U zdrowych kobiet wykazano dwufazowe zmiany HbA_1c w okresie ciąży, obniżenie stężenia HbA_1c w pierwszym i trzecim trymestrze ciąży oraz jego wzrost w drugim trymestrze [36, 37]. Przyczyna opisywanego wzrostu HbA_1c w drugim trymestrze jest dotąd nieznana. Być może wynika on z niedoboru żelaza, który rozwija się w ciąży. Podobnego zjawiska nie zaobserwowano w przypadku oznaczania GA [39]. U kobiet w ciąży chorych na cukrzycę również zaobserwowano wzrost HbA_1c w trzecim trymestrze ciąży, przy stabilnym stężeniu GA. Wiązano to ze wzrostem wysycenia transferryny i obniżeniem stężenia ferrytyny w surowicy krwi, co można tłumaczyć rozwijającym się niedoborem żelaza. Zatem HbA_1c nie jest odpowiednim wskaźnikiem do monitorowania wyrównania glikemii w okresie ciąży. Odpowiednim wskaźnikiem wydaje się zaś GA [39].

U pacjentów z przewlekłymi chorobami wątroby wartość HbA_1c może być zaniżona, a stężenia fruktozaminy, jak również GA są nieadekwatnie podwyższone, co wynika z wydłużenia okresu półtrwania albumin [40–42]. Do monitorowania wyrównania glikemii w przypadku współistniejącej cukrzycy i choroby wątroby wyznaczono wskaźnik, który jest średnią wartością HbA_1c i GA/3 [42].

W przypadku przewlekłej choroby nerek wartości HbA_1c mogą być zarówno zawyżone (obecność karbamino-Hb), jak i zaniżone, co jest efektem leczenia niedokrwistości nerkopochodnej przy użyciu erytropoetyny i preparatów żelaza [43]. W wielu badaniach wykazano, że GA może być użytecznym wskaźnikiem kontroli glikemii u chorych hemodializowanych. W przypadku obecności nefropatii cukrzycowej z jawnym białkomoczem wartości GA wydają się zaniżone (zwiększony metabolizm albumin) [43, 44].

Wykazano, że stężenie GA ma istotny związek z powikłaniami mikronaczyniowymi (choroba nerek, retinopatia), z powikłaniami makronaczyniowymi (prędkość fali tętna) oraz ze śmiertelnością całkowitą, w porównaniu z HbA_1c [45–47]. Jest też prawdopodobnie lepszym markerem kontroli glikemii u chorych z nefropatią (bez jawnego białkomoczu) niż HbA_1c. Dotąd brak dużych prospektywnych badań potwierdzających wpływ poprawy kontroli glikemii, a tym samym obniżenia stężenia GA na zmniejszenie śmiertelności oraz mikro- i makroangiopatii.

Podwyższone stężenie GA opisano również jako niezależny czynnik ryzyka pokontrastowego uszkodzenia nerek u chorych na cukrzycę typu 2 z upośledzoną funkcją nerek poddawanych zabiegom angioplastyki wieńcowej [48].

Na podstawie dostępnych danych na temat przydatności oznaczeń GA do monitorowania wyrównania metabolicznego cukrzycy wyszczególniono schorzenia oraz stany patologiczne w których oznaczanie tego wskaźnika powinno być rekomendowane. Należą do nich: chwiejność glikemii w przebiegu cukrzycy typu 1, chorzy z dominującą hiperglikemią poposiłkową, chorzy z niedokrwistością hemolityczną, z niedoboru żelaza, po przebytych krwawieniach, transfuzji krwi, leczeni preparatami żelaza oraz z hemoglobinopatiami, jak również chorzy z niewydolnością nerek, zwłaszcza hemodializowani, z marskością wątroby oraz kobiety ciężarne z cukrzycą.

1,5-anhydroglucitol

Omawiając markery wyrównania glikemii, warto również wspomnieć o 1-deoksyglukozie – formie glukozy znanej jako 1,5-anhydroglucitol (1,5 AG), który naturalnie pochodzi głównie z pożywienia, a tylko w niewielkim stopniu jest wytwarzany w organizmie. Jest łatwo przesączany w kłębuszkach nerkowych i następnie reabsorbowany w kanalikach proksymalnych. Jego stężenie w surowicy krwi utrzymuje się na poziomie 12–40 µg/ml [49]. Stężenie 1,5 AG obniża się po okresie 24 godzinnej hiperglikemii > 180 mg/dl, w efekcie zwiększonego wydalania przez nerki, ulega zaś wzrostowi po poprawie kontroli metabolicznej cukrzycy. Na podstawie oznaczeń stężenia 1,5 AG ocenia się wyrównanie glikemii w czasie ostatniego tygodnia. Im niższe stężenie anhydroglucitolu, tym częściej występują hiperglikemie poposiłkowe, przekraczające próg nerkowy. U chorych z niewydolnością nerek jego stężenie obniża się w związku ze spadkiem reabsorpcji, niezależnie od wydalania glukozy. Stwierdzono, że 1,5 AG może być pomocnym markerem wyrównania glikemii u pacjentów z cukrzycą typu 2 i przewlekłą chorobą nerek w stadium 1.–3. Nie powinno się go używać u chorych z zaawansowaną niewydolnością nerek, z chorobami wątroby, u kobiet w ciąży, z glukozurią nerkową i zaburzeniami wchłaniania. Ograniczone znaczenie i rzadkie zastosowanie tego markeru wynika między innymi z wpływu produktów dietetycznych na stężenie 1,5 AG w surowicy [49, 50].

Podsumowanie

Omówione powyżej alternatywne do HbA_1c biomarkery do monitorowania glikemii mają wiele zalet, ale również istotne ograniczenia. Najbardziej obiecująca wydaje się glikowana albumina. Wprowadzenie oznaczenia GA do codziennej praktyki klinicznej pozwoliłoby na szybsze wychwycenie zmian wyrównania glikemii w przypadku pogorszenia kontroli metabolicznej, a także na udokumentowanie poprawy wyrównania po wprowadzeniu odpowiedniego leczenia. Może to mieć przede wszystkim znaczenie dla chorych oczekujących na zabiegi kardiochirurgiczne, chirurgiczne czy ortopedyczne, które z powodu nieadekwatnej kontroli glikemii bywają odroczone. Monitorowanie GA zamiast HbA_1c w szczególnych grupach pacjentów (m.in.: chore w ciąży, pacjenci z niewydolnością nerek, ze schorzeniami hematologicznymi) lepiej odzwierciedla stopień wyrównania metabolicznego cukrzycy niż wskaźnik HbA_1c. Istniejące doniesienia potwierdzające związek między stężeniem GA a zmniejszeniem powikłań mikronaczyniowych cukrzycy stanowią podstawę do prowadzenia dalszych badań i wydają się obiecujące.

PIŚMIENNICTWO