Wstęp

Test cobas^® MPX przeznaczony jest do badań przeglądowych u dawców krwi wykonywanych na analizatorze cobas^® 6800. Jest to jakościowy test multiplex, wykorzystujący metodę real-time PCR, który wykrywa w osoczu i surowicy RNA: HIV-1 M, HIV-1 O, HIV-2, HCV oraz DNA HBV Test jednocześnie różnicuje zakażenia wirusami HIV, HCV, HBV.

Na analizatorze cobas^® 6800 można także wykonać badanie przeglądowe z użyciem testu cobas^® DPX, który jest przeznaczony do ilościowego badania DNA ludzkiego parvowirusa B19 (B19V) i detekcji RNA wirusa zapalenia wątroby typu A (HAV) w ludzkim osoczu.

Opcjonalnym elementem systemu jest cobas® p 680 – w pełni zautomatyzowane urządzenie pipetujące, przeznaczone do pulowania osocza. Aparat ten służy do tworzenia pul podstawowych z osocza pochodzącego z 1, 6, 24, 96 i 480 donacji. Pojedyncza spulowana próbka jest poddawana dalszym badaniom w aparacie cobas® 6800.

Celem badań była ocena przydatności testów cobas® MPX i cobas® DPX wykonywanych na aparacie cobas^® 6800 z zastosowaniem cobas^® p 680 w badaniach przeglądowych w krwiodawstwie. W trakcie badań analizowano między innymi czułość wykrywania poszczególnych markerów, zdolność identyfikacji donacji zakażonych oraz ryzyko uzyskania wyników fałszywie reaktywnych.

Materiał i metody

Czułość analityczną określano, badając w 24 powtórzeniach 6 kolejnych rozcieńczeń według międzynarodowych standardów (IS) WHO: HCV 06/102 (31,6–0,1 IU/ml), HIV-1 10/152 (100–0,32 IU/ml) i HBV 10/264 (10–0,03 IU/ml). Dodatkowo w 24 powtórzeniach badano rozcieńczenia odpowiednich materiałów kontrolnych: IS WHO HIV-2 (08/150) zawierające 31,6–0,32 IU/ml oraz Performance Panel HIV-1 (O) o stężeniu 100–3,16 kopii/ml (Sera Care 0800–0262). Analiza czułości analitycznej testu cobas^® DPX obejmowała badanie w 24 powtórzeniach każdej próbki z panelu rozcieńczeń materiału referencyjnego WHO genotypów B19V (09/110) – 6 rozcieńczeń genotypów 1–3 obejmujących stężenia od 31,6 IU/ml do 0,1 IU/ml oraz IS WHO RNA HAV (00/562) o rozcieńczeniach 10–0,03 IU/ml.

Poprawność identyfikacji wirusów za pomocą testu cobas^® MPX oceniano, badając: 1) próbki z wykrytym materiałem genetycznym (HCV i HIV NAT yield oraz seropozytywne HBV) o znanej wiremii, nierozcieńczone i rozcieńczone 1:6 (symulacja pul z 6 donacji), 2) 480 próbek (473 ujemne, 7 zawierających materiał genetyczny wybranych wirusów) w pulach po 6 donacji i mniejszych (imitacja badań przeglądowych). Jako symulację przebiegu badań przeglądowych w przypadku testu cobas^® DPX zbadano 767 donacji, w tym jedną z wysoką wiremią B19V w 8 pulach (7 pul po 96 donacji, 1 pula niepełna).

Wyniki

Czułość analityczna testu cobas^® MPX na poziomie 95% wykrywalności [LOD] (95-proc. przedział ufności) wynosiła: HBV – 3,97 IU/ml (2,25–9,75); HCV – 7,12 IU/ml (4,40–15,62); HIV – 31,33 IU/ml (17,84–76,80). Gdy analizowano wyniki rozcieńczeń IS HBV dobrane tak, by taka sama liczba rozcieńczeń charakteryzowała się stężeniem powyżej i poniżej przewidywanego 95% LOD, czułość analityczna wyniosła 2,4 IU/ml (1,54–5,99). Wynik dodatni uzyskano we wszystkich próbkach rozcieńczeń o stężeniach 100–10 kopii/ml oraz 31,6 i 10 IU/ml odpowiednio HIV-1 grupy O i HIV-2.

Wartość 95-procentowego limitu detekcji [LOD] (95-proc. przedział ufności) dla testu cobas^® DPX wynosiła odpowiednio: 8,70 IU/ml (4,92–21,69) dla genotypu 1; 37,8 IU/ml (22,24–93,65) dla genotypu 2 i 29,84 IU/ml (19,04–65,60) dla genotypu 3 B19V oraz 0,82 (0,49–1,96) dla RNA HAV

HBV (genotyp A, D i H), HCV (genotyp 1b, 3a i 4) i HIV (podtyp B HIV-1) poprawnie zidentyfikowano we wszystkich badanych próbkach NAT-dodatnich.

Wyniki badań imitujących badania przeglądowe z zastosowaniem testów cobas^® MPX i DPX były w 100% zgodne z oczekiwanymi wynikami, aczkolwiek próbki z B19V DNA > 109 IU/ml (powyżej zakresu liniowości testu) wymagały 1000-krotnego rozcieńczenia w celu uzyskania wyników ważnych.

Częstość wyników fałszywie reaktywnych przy użyciu testu cobas^® MPX wynosiła 0,1% (jeden prawdopodobny przypadek wyniku fałszywie reaktywnego). Biorąc pod uwagę, że 71% pul było zakażonych, wystąpienie tylko jednego wyżej wymienionego przypadku świadczy o tym, że metody zapobiegania kontaminacjom w ocenianych aparatach i teście są skuteczne. Należy pamiętać, że częstość zakażeń u dawców krwi, którzy będą badani za pomocą ocenianego testu/systemu, jest bardzo niska (< 1/100).

W trakcie badań prowadzonych z użyciem cobas^® DPX nie obserwowano wyników fałszywie reaktywnych i nieważnych.

Wnioski

Test cobas^® MPX wykazuje czułość i swoistość wymaganą dla testów przeglądowych NAT stosowanych w polskim krwiodawstwie. Przeprowadzenie badania z wykorzystaniem systemu cobas^® 6800 i p 680 umożliwia prawidłową identyfikację zakażonej donacji bez istotnego ryzyka uzyskania wyników fałszywie reaktywnych. Określenie rodzaju zakażenia nie wymaga przeprowadzenia dodatkowych testów różnicujących.

Test cobas^® DPX wykonywany na aparacie cobas^® 6800 i p 680 pozwala prawidłowo identyfikować dawców, których osocze może spowodować przekroczenie dopuszczalnego poziomu 104 IU B19V/ml w puli produkcyjnej w procesie produkcji składników osoczopochodnych. Dodatkowo pozwala na wykrycie zakażenia HAV

Już wkrótce planowane jest bardziej szczegółowe przedstawienie wyników badań na łamach „Journal of Transfusion Medicine”.

Konflikt interesów

Praca powstała na podstawie wykładu wygłoszonego podczas seminarium „Postępy w badaniach przeglądowych dawców krwi” (Warszawa, 5–6 października 2015 r.), organizowanego przez Roche Diagnostics Polska Sp. z o.o. pod nadzorem merytorycznym Instytutu Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie.

Adres do korespondencji: mgr Dorota Kubicka-Russel, Zakład Wirusologii, Instytut Hemtologii i Transfuzjologii, ul. I. Gandhi 14, 02–776 Warszawa, e-mail: drussel@ihit.waw.pl