Jednym z wiodących tematów omawianych na ostatnich zjazdach Międzynarodowego Towarzystwa Przetaczania Krwi (ISBT, International Society of Blood Transfusion) jest wykorzystanie metod biologii molekularnej w laboratoriach immunohematologicznych jako narzędzia uzupełniającego bądź wiodącego w określaniu antygenów grup krwi u dawców lub biorców krwi. Na XXXIII światowym zjeździe w Seulu, w Korei Południowej, zastosowanie metod analizy kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA, deoxyribonucleic acid) w badaniach antygenów krwinek czerwonych i płytkowych omawiano na sesjach „Genotypowanie Grup Krwi” (Blood Group Genotyping), „Białka Błonowe Krwinki Czerwonej” (Red Cell Membrane Proteins), „Genotypowanie grup krwi: nowy sprzymierzeniec w laboratorium” (Blood genotyping: a new ally in your lab) i na sesji satelitarnej zorganizowanej przez firmę Grifols. Doniesienia o wykorzystywaniu metod genotypowania grup krwi były także licznie prezentowane w sesji plakatowej w sekcji „Immunologia Krwinki Czerwonej” (Red Cell Immunology: Molecular).

Podczas zjazdu zaprezentowano doniesienia na temat wykorzystania różnych technologii do genotypowania grup krwi w ośrodkach badawczo-naukowych i laboratoriach immunologii transfuzjologicznej. W tych ostatnich metody molekularne są wykorzystywane głównie jako narzędzie do tworzenia rejestrów dawców krwi o oznaczonym rozszerzonym fenotypie. Niewątpliwymi zaletami metod analizy DNA są możliwość badań masowych o wysokiej powtarzalności i opłacalność ekonomiczna przy dużej skali testów, dzięki czemu można szybko i tanio identyfikować dawców o rzadkich grupach.

Rieneck i wsp. zaprezentowali w sesji plakatowej wyniki genotypowania 20 000 dawców krwi pochodzących z duńskiej populacji badanych w celu znalezienia osób o rzadkich antygenach erytrocytarnych: Kpb, Yta, Vel-ujemny lub płytkowych: HPA-la-ujemny. Wykryto czterech dawców Kpb-ujemnych, 35 dawców Yta-ujemnych, 478 HPA-1a-ujemnych oraz licznych Vel-ujemnych, a koszt detekcji (bez izolowania DNA) oszacowano na 14 centów amerykańskich za cechę dla jednej osoby.

Punktem wyjścia wykładu dr Delaney (Genotyping Blood Donors for Improved Transfusion Care) była analiza własnych obserwacji dotyczących trudności w doborze krwi do przetoczeń u wielokrotnych biorców krwi. Spośród tych pacjentów 20–40% wytwarza przeciwciała – przede wszystkim do antygenów z układu Rh oraz Kell, ale także do innych antygenów. Zapewnienie tym chorym krwi do przetoczenia, szczególnie w sytuacjach pilnej transfuzji, jest dużym wyzwaniem. Dobór dawców krwi pod kątem zgodności w zakresie rozszerzonego fenotypu wymaga posiadania dużego rejestru dawców o oznaczonym rozszerzonym fenotypie. Prelegent podkreślił rolę metod analizy DNA w badaniach masowych związanych z tworzeniem takiego rejestru i zaprezentował wyniki własne badań 15 000 dawców, wśród których zidentyfikowano 55 posiadających antygeny zaliczane do antygenów rzadkich, a 1247 – niepowszechnych. Zaznaczył, że przy doborze metody i zakresu genotypowania należy kierować się lokalnymi potrzebami i uwarunkowaniami oraz opracować plan genotypowania dawców w odniesieniu do możliwości ekonomicznych danego ośrodka, szczególnie przy poszukiwaniu cech rzadkich, gdy badania dotyczą dużych liczebnie grup. Na zakończenie prelegent podkreślił, że z jednej strony obecnie wykorzystywane są w pełni skomputeryzowane platformy do genotypowania grup krwi o wysokiej przepustowości, z drugiej zaś uzupełnianie baz danych wciąż odbywa się ręcznie przez operatora, gdyż brakuje rozwiązań umożliwiających przepływ informacji między wykorzystywanymi platformami a systemami szpitalnymi czy laboratoryjnymi. Wskazał także na fakt, że w dobie zaawansowanych technologii wykorzystywanych do oznaczenia rozszerzonego genotypu grup krwi, sposób znakowania i opisywania jednostek krwi wymaga unowocześnienia.

Obok powszechnie stosowanych protokołów typu home-made, opartych na klasycznych metodach biologii molekularnej, oraz zaawansowanych technologii i testów ze znakiem dyrektywy dla wyrobów medycznych do diagnostyki in-vitro (IVD, in vitro diagnostic device directive) do typowania antygenów grup krwi, następuje szybka implementacja najnowszej technologii sekwencjonowania następnej generacji (NGS, next generation sequencing) do badań polimorfizmów, które stanowią podłoże swoistości antygenowych. Profesor Avent zaprezentował wstępne wyniki badań genotypowania grup krwi przy użyciu tej technologii na platformie urządzenia Ion Torrent™ Personel Genome Machine (Next generation sequencing: academic overkill or high-resolution blood group genotyping?) [1]. Badacze opracowali kolejne etapy sekwencjonowania antygenów z układów Rh, Duffy i Kidd: przygotowanie biblioteki przez amplifikację całkowitej sekwencji genomowej alleli kodujących swoistości antygenowe z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy o dużym zasięgu (long-range PCR, long-rangepolymerase chain reaction), ich fragmentację i ligację z oligonukleotydami adaptorowymi, zawierającymi sekwencje kodu z identyfikatorem, aż po sekwencjonowanie mieszaniny 70 próbek na raz. Wyniki dla genów RHD/RHCE pokrywały się z wynikami serologicznymi tylko dla osób heterozygotycznych pod względem antygenu D, a w pozostałych przypadkach, ze względu na wysoką homologię sekwencji genów RHD i RHCE oraz występowanie genów hybrydowych RHD-CE-D, problem stanowiło dopasowanie, z którego chromosomu pochodzi badany fragment. Tu badacze wskazali na konieczność stosowania długich amplikonów i rozdzielenia badań genów RHD i RHCE. W podsumowaniu wykładowca podkreślił, że technika NGS, początkowo stosowana tylko w ośrodkach badawczo-naukowych, obecnie (dzięki temu, że koszt NGS spadł znacznie w ciągu ostatnich 5 lat) staje się coraz szerzej dostępna dla małych laboratoriów diagnostycznych. Zastosowanie jej umożliwia posiadanie pełnej sekwencji DNA dawcy lub pacjenta i jej szybkie dopasowanie do fenotypu przez porównanie do danych w coraz bogatszych i pełniejszych bazach genetycznych dotyczących antygenów grup krwi. Należy przypuszczać, że w najbliższym czasie nastąpi uproszczenie obróbki bioinformatycznej surowych wyników przez powstanie prostych programów do przeszukiwania baz i do tworzenia raportów z genotypowania antygenów grup krwi.

Dodatkowe informacje techniczne dotyczące wykorzystania NGS zaprezentowano także w doniesieniu plakatowym (Altayar i wsp. [2]). Pełne zsekwencjonowanie alleli kodujących antygeny z układu Duffy wykazało obecność dwóch dodatkowych miejsc polimorficznych w eksonie drugim (obok kodujących antygen Fya i Fyb) i czterech we fragmentach intronowych genu. Podobny obraz występowania trzech polimorfizmów w eksonach i licznych – 132 zmian pojedynczego nukleotydu (SNP, single nucleotide polymorphism) lub insercja/delecja we fragmentach intronowych wykazano dla alleli kodujących antygeny z układu Kidd w 32 przebadanych próbkach. Określono wzory mutacji intronowych dla poszczególnych genotypów: osiem wzorów dla JK*A-/JK*B+, dwa dla JK*A+/JK*Bi dwa dla JK*A+/JK*B+. Nie zaprezentowano wyników sekwencjonowania antygenów z grup głównych AB0, dla którego protokół nadal wymaga dopracowania.

Metody molekularne znajdują szerokie zastosowanie jako narzędzie weryfikacji oznaczeń serologicznych, szczególnie w identyfikacji antygenów o osłabionej ekspresji. W wykładzie pod tytułem Kidd antigen discrepancies: genotype-predicted phenotype vs serologic phenotype profesor Keller z Amerykańskiego Czerwonego Krzyża (American Red Cross) podsumował wyniki badań genotypu antygenów z układu Kidd techniką HEA BeadChip u ponad 60 000 dawców z oznaczonym fenotypem Jk [3]. Badacze wykryli siedem niezgodności między genotypem i przewidywanym fenotypem a oznaczeniami serologicznymi – dwa pod względem określenia obecności antygenu Jka i pięć dotyczących antygenu Jkb. Dalsze badania technikami: analizy długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP-PCR, restriction fragment length polymorphism-polymerase chain reaction), allelospecyficznej reakcji łańcuchowej polimerazy (SSP-PCR, single strand conformation polimorphism-polymerase chain reaction) oraz sekwencjonowania wykazały, że w pięciu przypadkach rozbieżnych wyników wykryto allele JK*null odpowiedzialne za brak ekspresji antygenu Jkb. Analiza rozbieżności wyników genotypowania antygenu Jka w jednym przypadku wykazała obecność allelu JK*01W.01 związanego z powstawaniem fenotypu Jk(a+) o osłabionej ekspresji dającego fałszywie ujemny wynik fenotypowania. W drugim przypadku metodą sekwencjonowania wykryto nowy wariant allelu JK*A, dający fałszywie negatywny wynik genotypowania. W podsumowaniu badacze podkreślili, że rozbieżności wyników genotypowania allelu JK otrzymane techniką HEA BeadChip i fenotypowania antygenów Jka i Jkb są bardzo rzadkie (7/60 000), co dowodzi wysokiej wiarygodności stosowania metod molekularnych w determinacji antygenów z tego układu. Podobnie profesor Avent i wsp. przy użyciu technologii NGS stwierdzili znacznie wyższą częstość występowania (od opisywanej w literaturze) allelu JK*A weak kodującego warianty antygenu Jk(a) o osłabionej ekspresji. Metodami serologicznymi takie warianty są określane jako Jk(a-).

Profesor Hyland z Australijskiego Czerwonego Krzyża (Australian Red Cross) przeprowadziła analizę rozbieżności wyników genotypowania a fenotypowania dla antygenów z układu Duffy [4]. Wśród 256 badanych przypadków badacze wykryli 5% oznaczeń serologicznych fałszywie ujemnych dla antygenu Fyb, podczas gdy techniką wysokiej rozdzielczości topnienia (HRM-PCR, high-resolution melting) lub z użyciem platformy BLOODChip wykazano obecność allelu FY*02W.01 kodującego antygen Fyb+w o osłabionej ekspresji. W trzech przypadkach jako przyczynę wyniku fałszywie FY*A-dodatniego ustalono obecność wariantów nieulegających ekspresji, a w jednym stwierdzono obecność wariantu allelu FY*A kodującego antygen Fya+ o osłabionej ekspresji nie wykrywany rutynowo stosowanymi testami serologicznymi. Badacze podkreślili dużą częstość występowania rozbieżności między technikami genotypowania a fenotypowania i potrzebę opracowania algorytmu włączenia badań genotypu antygenu Fya/Fyb jako koniecznego uzupełnienia oznaczeń serologicznych.

W sesji plakatowej także zaprezentowano szereg doniesień o wykryciu nowych alleli kodujących warianty wyrażające się osłabionym fenotypem lub nieulegające ekspresji, które wykryto metodami analizy DNA.

W swoim doniesieniu de Haas i wsp. opisali podłoże genetyczne wariantów fenotypu Kell spotykanych w populacji holenderskiej [5]. Wśród 407 przebadanych dawców KEL: 1,-2 u 7,4% wykryto rozbieżności wyniku genotypowania i oznaczeń serologicznych, u 4% zidentyfikowano KEL*02.mod, a u 2,7% – KEL*02null, w tym siedem nowych wariantów nieulegających ekspresji. Henny i wsp. opisali wykrycie 3 nowych alleli JK wśród dawców szwajcarskich [6]. Badania prowadzono techniką SSP-PCR typu home-made opracowaną do wykrywania 22 alleli kodujących antygeny grup krwi. Badacze uzyskali 15 rozbieżności genotypu względem oznaczeń serologicznych w układzie Kidd – w czterech przypadkach stwierdzono błąd w fenotypowaniu, a w pięciu techniką sekwencjonowania wykryto 3 nowe warianty: JK*01(del516–530), JK*02.810G>A, dające brak ekspresji antygenów, i jeden JK*02.988A.1095C o obniżonej ekspresji antygenu Jkb.

Westhoff i wsp. zaprezentowali doniesienie Identification of two new alleles in the FY system associated with silencing of antygen expression, w którym opisali wykrycie nowych alleli FY*02.895G>A oraz FY*02.(del179–180) u dawców z rozbieżnymi wynikami fenotypowania i genotypowania techniką HEA BeadChip [7].

Vrignaud i wsp. zaprezentowali wykrycie 11 nowych polimorfizmów typu SNP w genie RHCE kodujących antygeny C, E lub e z układu Rh o osłabionej ekspresji [8].

Metody analizy DNA stosuje się w przypadku braku lub ograniczonego dostępu do odczynników diagnostycznych, takich jak surowice z przeciwciałami anty-Vel czy anty-MAR-like. W sesji „Białka błonowe krwinki czerwonej” naukowcy z Uniwersytetu Lund w Szwecji (Christophersen i wsp.) przedstawili analizę molekularnych podstaw zmienności poziomu ekspresji tego antygenu u osób Vel-dodatnich [9]. W zeszłym roku badacze opisali wykrycie u osób o fenotypie Vel-ujemnym delecji 17 nukleotydów w genie SMIM1. Przy użyciu metod biologii molekularnej, takich jak sekwencjonowanie, reakcja łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (real-time PCR, real-time polymerase chain reaction) oraz cytometria przepływowa z ludzkimi przeciwciałami anty-Vel badacze zidentyfikowali w intronie drugiego genu dwa polimorfizmy jednonukleotydowe, których obecność jest mocno skorelowana z poziomem ekspresji antygenu Vel. U homozygot noszących allel „minor” wraz ze sprzężonymi z nim dwoma polimorfizmami obserwowano wysoką ekspresję SMIM1 zarówno na poziomie wykrywanego matrycowego kwasu rybonukleinowego (mRNA, messenger ribonucleic acid) białka, jak i samego antygenu Vel w błonie komórek. W drugim doniesieniu badacze holenderscy (van der Schoot i wsp.) opisali walidację testu genetycznego do wykrywania dawców o rzadkim fenotypie Vel-ujemnym [10]. Ze względu na różny poziom ekspresji antygenu Vel i brak odczynników do powszechnych badań serologicznych autorzy opracowali test do badań o wysokiej skali przepustowości wykrywający allel SMIM1*64_80del, występujący u osób Vel-ujemnych. Określili częstość występowania tego allelu na 1,46% wśród rasy białej, 0,56% – negroidalnej i 0,60% – żółtej.

Genotypowanie grup krwi jest też przydatne w doborze panelu dawców do identyfikacji przeciwciał. W sesji plakatowej zaprezentowano doniesienie o opracowaniu metody screeningu genetycznego antygenu Cw z układu Rh w celu wytypowania dawców panelowych do badań. Techniką SSP-PCR badacze (Crottet i wsp.) przebadali 747 dawców, określonych jako Cw-dodatni, i wykryli 7 dawców Cw homozygotycznych, o rzadkim fenotypie Mar-ujemnym, z których jeden został cennym dawcą panelowym dla centrum krwiodawstwa [11].

Jedną z ostatnio coraz szerzej stosowanych aplikacji jest wykorzystanie badań genotypowania do oznaczania antygenów u pacjentów w celu podwyższenia skuteczności i bezpieczeństwa transfuzji. W doniesieniu plakatowym Belsito i wsp. przebadali 225 dawców i 50 pacjentów zależnych od transfuzji, wykorzystując do genotypowania platformę HEA BeadChip, a do fenotypowania analizator NEO Immucor (Erythrocyte genotyping: our experience at second university of Naples) [12]. Wyniki oznaczenia antygenów RhC, E i Kell obiema metodami wykazały jeden wynik rozbieżny w grupie dawców i aż 27/50 w grupie pacjentów. W związku z tym autorzy podkreślili fakt konieczności genotypowania antygenów krwinki czerwonej u biorców zależnych od transfuzji. Zaznaczyli, że takie postępowanie pozwoli na weryfikację i poszerzenie oznaczeń serologicznych u pacjentów i prawidłowe dobranie dawców, a przez to zapobiegnie alloimmunizacji biorcy oraz wpłynie na skrócenie czasu i obniżenie kosztów związanych z kolejnym doborem.

Podsumowując, można zauważyć jak ogromne zainteresowanie metodami genotypowania antygenów krwinki czerwonej i wzrastająca dostępność platform oraz technologii do badań o wysokiej przepustowości przekłada się na wzrost wiedzy na temat bogactwa podłoża molekularnego różnych swoistości antygenowych. To przekłada się na bardzo szybką rozbudowę baz genetycznych z pełnymi sekwencjami nowych alleli, zarówno nieulegających wyrażaniu, jak i o obniżonej ekspresji. Gromadzone obecnie w laboratoriach całego świata dane genetyczne posłużą w przyszłości do utworzenia programów porównujących wykrytą sekwencję z badaną, poprawnego przewidywania fenotypu pacjenta, a także doboru krwi od dawcy o identycznym genotypie. Obecnie analiza DNA do badań antygenów krwinek koncentruje się przede wszystkim na typowaniu wielokrotnych dawców krwi w celu wynajdywania osób z rzadkimi antygenami lub genotypami występującymi z niską częstością, ale także w coraz większym stopniu badania stają się powszechne w odniesieniu do pacjentów wymagających wielokrotnych transfuzji. Dodatkowo przeprowadzone badania całych sekwencji genów dostarczają informacji o występowaniu wzorów mutacji polimorficznych w innych regionach alleli kodujących antygeny grup krwi, a znaczenie wykrywanych sprzężeń w odniesieniu do zjawisk immunologicznych staje się kolejnym wyzwaniem dla badaczy.

Adres do korespondencji: dr n. biol. Agnieszka Orzińska, Zakład Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej, Instytut Hematologii i Transfuzjologii, ul. Chocimska 5, 00–975 Warszawa, tel.: 22 349 66 73, faks: 22 349 66 14, e-mail: orzinska@ihit.waw.pl