Dorota Dworakowska M.D., Department of Nuclear Medidne, Medical University of Gdansk, 3a Skłodowskiej-Curie Str., 80-210 Gdansk Poland, e-mail: ddw@gumed.edu.pl

Introduction

Adrenocortical tumours (ACTs) are relatively common tumours, the prevalence of which tends to increase with patient age. Adrenal incidentalomas are found in approximately 4% of CT scans and in 6% of autopsies, but this is probably still an underestimate. Although the majority of ACTs are non-functional adrenocortical adenomas (ACAs), there are cases of functional adenomas associated with hypercortisolaemia and/or hyperaldosteronism [1, 2]. On the other hand, the malignant form, adrenocortical carcinoma (ACC), occurs rarely, with an annual incidence of 0.5-2 per million population [3] and 0.3 per million for children younger than 15 years [4]. ACC generally presents either during childhood (prior to the age of five years) or during the fourth and fifth decade, being more common in women than in men [1, 5].

The histopathological diagnosis of ACC has been controversial, and several scoring systems have been proposed to establish a reliable diagnosis [6-9]. The Weiss system has been the most frequently used since 1984 [10]. It is based on histological analysis and is valued for its simplicity and ease of use. Still, there arises a clinical requisite for a reliable classification of a tumour to either benign or malignant group in order to discern the possible metastatic conditions as soon as possible.

The prognosis of adrenocortical cancer is very poor, with an overall five-year survival rate of less than 35%. The majority of patients at diagnosis present with advanced but localised disease, which is limited to adrenal glands and qualifies for surgical removal. Nevertheless, around 30-40% of ACCs have clear evidence of metastasis at clinical presentation, and the available systematic treatments rarely yield a complete remission [11, 12].

The first-line therapeutic approach for ACC is a complete surgical resection of the tumour; however, it does not guarantee full recovery; post-surgery recurrence occurs in around 70-80% of cases [13]. In order to improve the prognosis, the administration of mitotane is recommended, alone or in combination with cytotoxic chemotherapy. Mitotane is considered the first-line adjuvant therapy, improving recurrence-free survival, but at best 24% of the patients show an objective tumour response [11, 14, 15]. As this therapeutic strategy remains unsatisfactory, there is a requirement for new therapeutic options for ACC that would improve survival rates and decrease recurrences.

Most ACCs are sporadic; however, the literature provides numerous reports of familial syndromes associated with an increased prevalence of ACC, such as Li-Fraumeni or Beckwith-Wiedemann syndromes, which have characteristic genetic alterations [16]. Likewise, ACC has been intensively studied from the molecular perspective, offering insights into the molecular basis of this cancer [17-24].

In this article, we review the molecular alterations that may play a role in adrenocortical carcinogenesis, and we have attempted to define the interactions between the involved genes, proteins and signalling pathways, and diagnostic and treatment options.

Molecular pathology of adrenocortical carcinoma

Our knowledge of the molecular events underlying adrenocortical carcinoma has improved in recent years, but still the precise mechanisms and interactions between various contributing factors need to be elucidated. High-throughput gene expression assays based on transcriptomes, which enable the study of a large number of genes in a single experiment, have revealed distinct profiles for benign and malignant adrenocortical tumours, offering a new diagnostic tool and possibly improved treatment [17-24]. The mean number of genetic alterations was reported to be considerably higher for carcinomas than for adenomas [17, 18, 20, 25]. The alterations occurring in ACCs include changes in expression, mutations, copy-number variations, and loss of heterozygosity (LOH); they span the whole genome (Fig. 1) and are associated with multiple cellular processes.

Among the most frequent molecular events playing crucial roles in the formation of malignant adrenocortical lesions are: IGF2 (insulin-like growth factor) overexpression, TP53-inactivating mutations (p53 protein), and constitutive activation of Wnt/β-catenin signalling pathway via activating mutations of the β-catenin gene (CTNNB1). Alterations in protein kinase A (PKA) and steroidogenic factor 1 (SF-1) are also involved in adrenocortical carcinogenesis. Recent studies have revealed that these cannot be treated as the only drivers of malignant adrenocortical tumourigenesis, but as secondary contributors, and other accompanying factors may also play a role [26, 27]. The types of mutations observed in sporadic ACCs are very similar to that of inherited tumours (see next section), with missense changes being the most common.

Insulin-like growth factor 2 pathway

Insulin-like growth factor 2 (IGF2) exerts its function through binding to the membrane tyrosine kinase receptor (TKR), IGF1R. After the ligand is bound, the receptor autophoshorylates and the insulin receptor substrate 1 (IRS-1) is recruited [28]. Tyrosine phosphorylation of IRS-1 activates the downstream signalling of pathways, such as PI3K/Akt/mTOR and Ras/Raf/MEK/ERK.

The genetic alterations at the 11p15.5 locus in sporadic ACCs primarily include: rearrangements, LOH, paternal isodisomy, and abnormal imprinting. These events result in a decrease in p57kip2 and H19, and an increase in IGF2 mRNA levels, which have been correlated with a worse prognosis and higher risk for ACC recurrence [29, 30]. However, the most frequent transcriptional change in ACC, occurring in over 80% of cases, is over-expression of the IGF2 gene [21, 24, 26, 31-36]. Later referred to as „the adrenal-specific malignancy signature”, as it is characteristic of ACC, but not ACA or the normal adrenal gland, this molecular alteration was initially studied in association with Beckwith-Wiedemann syndrome (see next section). The IGF2 cluster is a group of related genes that also show elevated expression in ACC and includes predominantly genes for growth factors and their receptors [18, 37]. The IGF2 cluster also contains a gene for insulin-like growth factor-binding protein 2 (IGFBP2), acting as a carrier protein for IGF2; its expression and plasma level have been correlated with tumour mass in ACC [38]. For paediatric tumours, IGF2 levels are similar in adenomas and carcinomas. However, the difference lies in IGF1R gene expression, which seems to be the prime indicator of malignant adrenocortical tumours in children [39, 40].

TP53 signalling pathway

The alterations within TP53 gene in ACCs occur mainly within exon 5, the ‘hot spot’, but exons 6, 7, 8, and 10 are also affected [41, 42]. TP53 mutations occur side by side with p53 accumulation, as revealed by immunohistochemistry [43]. Somatic inactivating TP53 mutations are among the most frequently reported in ACC, estimated to occur in 15-70% of cases [19, 44–46] and correlating with larger size, more advanced stage, higher metastatic rate, and shorter disease-free survival [43, 47].

Wnt/β-catenin signalling pathway

The Wnt/β-catenin cascade regulates proliferation, differentiation, survival, and apoptosis, with overlapping actions in a range of pathways, such as: TP53, TGFβ, PBK/Akt/mTOR, and Ras/Raf/MEK/ERK. In the adrenal cortex, the Wnt/β-calenin cascade is involved in adrenal development and differentiation [48, 49]. Abnormal functioning of this system may lead to adrenal tumourigenesis. The most pronounced underlying molecular implications include abnormal cytoplasmic and nuclear accumulation of β-catenin as well as somatic activating mutations of the β-catenin gene (CTNNB1). These events occur almost exclusively in ACCs with poor prognosis [19, 46, 50, 51]. Another target for the Wnt/β-catenin pathway, ectodermal-neural cortex protein 1 (ENC1), is up-regulated in adrenocortical carcinomas [52]. Recently, in ACA and ACC samples, an in-frame 12-bp deletion has been found in the AXIN2 gene, a negative regulator of Wnt/β-catenin signalling [53].

cAMP/PKA pathway

Modifications in the protein kinase A (PKA) R1A subunit, the core of the cAMP pathway, occur repeatedly among Carney complex patients (see next section). Bertherat et al. have shown that losses of 17q23-q24 loci are frequent in adrenocortical tumours, with a higher frequency in carcinomas than in adenomas. However, PRKAR1A gene mutations were detected in ACAs but not ACCs, suggesting a different role of PKA in tumourigenesis in benign and malignant lesions [54], Consistently, defective R2B subunit (PRKAR2B gene, 7q22.3) expression is present in secreting adenomas with no change in secreting carcinomas and non-secreting adenomas [55]. Loss of the R1A subunit was reported to increase rnTOR signalling [56]. The cAMP-dependent ACTH/G_s/PKA cascade plays a key role in regulating glucocorticoid and androgen production. Genetic modifications or expression changes of cAMP pathway genes associated with altered secretion and formation of adrenocortical carcinomas include:

• decreased expression and LOH of the ACTH receptor [57];
• genetic defects in PDE8B gene (phosphodiesterase 8B) [58];
• decreased expression of cAMP-responsive element binding protein (CREB) [59, 60];
• higher telomerase activity [60];
• decreased expression of ICER (inducible cAMP early repressor) isoforms, derived from an internal promoter of CREM gene (for cAMP responsive element modulator) [60].

Opposite changes are reported in ACA, suggesting that such changes may be indicators of malignancy. However, most of these alterations are associated with Cushing’s syndrome, which suggests that altered functioning of cAMP signalling is strongly correlated with that specific type of tumour of the adrenal cortex.

Steroidogenic pathway

Nuclear receptor steroidogenic factor 1 (SF-1, NR5A1) acts as a master regulator of adrenocortical differentiation and steroidogenesis by controlling the expression of cytochrome P450 steroidogenic enzymes. SF-1 is involved in the proliferation, apoptosis, angiogenesis, adhesion, and cytoskeleton dynamics of adrenocortical cells [61, 62]. High levels of SF-1 were reported to increase the proliferation rate of adrenocortical cells and to decrease the secretion of cortisol and aldosterone, with no effect on dehydroepiandrosterone (DHEA). Multiple copies of SF-1 (NR5A1) gene stimulate tumour development [63]. A study focusing on the SF-1 inhibitor, Pod-1 (capsulin, epicardin, Tcf21), established that the TCF21 gene is down-regulated in ACCs, compared with ACAs and normal tissue [64]. SF-1 over-expression is much more significant in childhood than in adult ACTs. In the majority of paediatric tumours the number of SF-1 gene copies is increased as a result of chromosome gain or amplification at 9q33 [65-67]. SF-1 also shows prognostic information: higher expression correlates with more advanced tumour stage, poorer clinical outcome, and shorter overall survival [68, 69].

Another factor involved in steroidogenesis is ACTH (adrenocorticotrophic hormone, corticotrophin); it plays a key role in the maximal cell-specific expression of steroidogenic enzymes needed for the synthesis of glucocorticoids and androgens in the zona reticularis and zona fasciculata. It acts through receptors coupled to Gs protein, increasing the levels of cAMP and thus inducing PKA, which in turn stimulates the expression of P450 steroidogenic enzymes. Generally, the ACTH/Gs/PKA cascade is crucial for maintaining a highly differentiated adrenal phenotype, but is only of moderate importance for cell proliferation [70, 71]. Adrenocortical carcinomas show decreased expression levels and LOH of the ACTH-R gene encoding the corticotrophin receptor [57, 60].

A cluster of steroidogenesis genes also differentiates ACC from ACA and contains: CYP11A1 (cytochrome P450scc, cholesterol desmolase), CYP11B1 (P450c11B1, 11β-hydroxylase), CYP17A1 (P450c17, 17α-hydroxylase), CYP21A2 (P450c21, 21-hydroxylase), HSD3B1 (3β-hydroxysteroid dehydrogenase/Δ-5-4 isomerase type), and STAR (StAR, steroidogenic acute regulatory protein). In contrast to IGF2 cluster expression, this steroidogenesis cluster shows low expression in adrenocortical carcinomas and is high in adenomas. This is in line with glucocorticoid overproduction in ACAs [37]. The link between IGF2 and steroidogenesis pathways is observed particularly during adrenal development and differentiation. IGF2 stimulates expression of ACTH-regulated steroidogenic enzymes, such as P450scc, P450c17, and HSD3B1 [29]. Recent studies also indicate connections with TGFβ and Wnt/β-catenin signalling. However, the precise mechanisms of that interrelation are yet to be identified [62, 72]. The suggested explanation indicates the involvement of a downstream target for Wnt/β-catenin signalling pathways, SGK1, serum and glucocorticoid-regulated kinase 1, which has been reported to show lower expression in adrenocortical carcinomas. SGK1 is a serine/threonine kinase that may be regulated by a number of factors, including corticosteroid hormones, growth factors, p53, and mTORC2 [73].

Other growth factors and their receptors

As well as IGF2, several other growth factors play a role in adrenocortical tumourigenesis, indicating cell signalling network interconnections. The mTOR upstream factors involved in ACC development include vascular endothelial growth factor (VEGF), epidermal growth factor (EGF), and IGF2; additionally, mTOR may modulate IGF2 and VEGF expression, acting as its stimulator [74]. As one of the major angiogenesis agents in solid tumours, VEGF showed highest levels in carcinomas among various adrenal neoplasm types [75-77]. Increased VEGF concentration is highly correlated with IGF2 over-expression, in line with its autocrine/paracrine regulation of tumour cell growth [77].

Likewise, epidermal growth factor receptor (EGFR) shows elevated levels in adrenocortical carcinomas [78-81]. EGFR is a potential malignancy marker, as its expression is significantly higher in carcinomas than in adenomas. The EGF receptor belongs to the ErbB family of TKRs and is involved in cell proliferation and survival. Downstream signalling pathways include Ras/Raf/MEK and STAT cascades [81]. Kotoula et al. performed a study focused on mutations in the EGFR gene, which were detected in its TK domain in relatively small numbers (11%) of carcinomas [82].

Fibroblast growth factor receptors (FGFR1 and FGFR4) may serve as malignancy markers, as their concentration is markedly higher in ACCs than in ACAs and normal tissue [33, 37, 46, 52, 83-85]. They reveal interactions with IGF2 (suppression by basic FGF2) and NRAS, an immediate downstream target for FGFR signalling. FGFR1 and FGFR4 belong to the IGF2 cluster genes, their over-expression correlating directly with IGF2 [33].

Transforming growth factors α (TGFα) and β (TGFβ1 and TGFβ2) are produced in normal adrenocortical cells to control steroidogenesis by inhibiting the expression of STAR (for steroidogenic acute regulatory protein), CYP17A1, and other genes [79, 86]. These two growth factors share the same receptors, type 1 and 2. Their over-expression in ACCs, but not in ACAs, was observed for TGFβ2 and TGFβR1 genes, suggesting their possible use as markers of malignancy. Conversely, the expression of TGFβR3 (encoding beta glycan, transforming growth factor β receptor 3) is markedly higher in adenomas when compared with carcinomas. TGFβ2 and TGFβR1 belong to the IGF2 cluster, while TGFβR3 is part of the steroidogenesis cluster [37].

In the TGFβ superfamily, activins and inhibins are closely related protein complexes with a structure based on collective elements, but exerting almost opposite effects. Inhibin is composed of an α-subunit and a β-subunit that has two variants, βA and βB, and is expressed only by ovary, testis, placenta, and adrenal cortex, i.e. steroidogenic tissues. Activin comprises two β subunits (βA, βB, βC, βE), shows more generalised presence in tissues, has an inhibitory effect on adrenocortical cell growth and steroid production, but stimulate apoptosis in the adrenal foetal zone. The role of inhibins is indirect regulation of steroid production via blockade of the binding between activins and their receptors [87]. The profiles of expression of INHA (inhibin α-subunil), INHBA (inhibin βA-subunit), ACVR2A (activin type IIA receptor), ACVR2B (activin type IIB receptor), and FST (follistatin, activin-binding protein) seem to be similar to lital of TGFβR3, being lower in ACCs and higher in ACAs [37, 88]. However, most ACTs are positive for INHA expression, making it a possible marker for distinguishing them from non-adrenocortical tumours. ACTs characterised by sporadic chromosomal losses in INHA gene are predominant among childhood neoplasms [89].

Cell cycle

Proteins involved in G1/S transition that are overexpressed in adrenocortical carcinomas include: cyclins D1 (CCND1 gene), El (CCNE1), and E2 (CCNE2), cyclin-dependent kinases 1 (CDK1, previously CDC2), 2 (CDK2), and 4 (CDK4), as well as cyclin-dependent kinase inhibitor 3 (CDK2-associated dual specificity phosphatase) (CDKN3) [21, 46, 52, 90-93]. Among G2/M proteins, over-expression was described for cyclins A2 (CCNA2), B1 (CCNB1), and B2 (CCNB2), cyclin-dependent kinases 1 (CDK1) and 7 (CDK7), cell division cycle 25 homologue C (CDC25C), and DNA topoisomerases I (TOP1), and II α (TOP2A) [21, 52, 90-92, 94]. Compared with ACA and controls, ACC also reveal decreased expression of cyclin-dependent kinase inhibitors 1C (p57, Kip2) (CDKN1C) [33, 52, 93] and 2A (p16) (CDKN2A) [37, 46], as well as the jun proto-oncogene (JUN) [91] and reprimo, TP53-dependent G2 arrest mediator candidate (RPRM) [90]. Proteins p57, p16, and jun are involved in G1/S phases, while reprimo acts in G2/M.

MicroRNAs

MicroRNAs are small, 20-22 nucleotides in length, noncoding RNAs that act at a transcript level, regulating gene expression in a sequence-specific manner; they are deregulated in many types of cancer, indicating their role in tumourigenesis [95]. One of the most extensively studied rniRNAs is hsa-miR-483-5p. It is up-regulated in ACCs in comparison with ACAs and normal tissue, and is associated with a poorer prognosis [96-98], miR-483-5p lies at the llpl5.5 locus within the most frequently over-expressed gene in ACCs, namely IGF2 [97]. Therefore, the level of miR-483-5p may be used as an indicator of the level of IGF2 in ACTs, and it enables straightforward patient assignment for treatment and clinical trials aiming for IGF2-related signalling pathways. Another microRNA is expressed from the same intron 2 of IGF2 gene, but it originates from the 3’ arm of the precursor miR-483 and, consequently, was named hsa-miR-483-3p and revealed similar changes in ACC [97, 98]. In childhood adrenocortical tumours, over-expression of miR-483-3p, but not miR-483-5p, has been reported [99].

Other microRNAs over-expressed in ACCs include hsa-miR-139-5p (11q13.4), hsa-miR-181b (1q32.1), hsa-miR-184 (15q25.1), hsa-miR-210 (11p15.5), and hsa-miR-503 (Xq26.3) [90, 96, 98, 99]. Conversely, a number of miRNAs are under-expressed in ACC; these include hsa-miR-7 (9q21.32), has-miR-99a (21 q21.1)/hsamiR-100 (11q24.1), hsa-miR-195 (17p13.1), hsa-miR-214 (1q24.3), hsa-miR-222 (Xp11.3), hsa-miR-335 (7q32.2), and hsa-miR-375 (2q35) [90, 96-100]. The activity of microRNAs may influence a number of cell-signalling cascades. For example, miR-184, miR-7, miR-99a, and miR-100 regulate at multiple levels the PI3K/Akt/mTOR pathway, while miR-335 and miR-375 have an impact on the Wnt signalling. Furthermore, miR-503 and miR-195 are involved in the regulation of the cell cycle G1/S transition [95, 99]. A recent study by Caramuta et al. was the first to investigate the components of the microRNA biogenesis pathway. The results uncovered a set of genes shown to have higher expression in ACC than in ACA and controls: TARBP2 (TAR RNA binding protein 2), DICER1 (dicer 1, ribonuclease type III), and DROSHA (drosha, ribonuclease type III), key factors in miRNA processing [101].

Steroid hormone receptors

Sex steroids (oestrogens and androgens) have been reported to be crucial in the aetiology and development of endocrine-related malignancies of breast, ovary, and prostate [102]. Symptomatically, androgen-secreting ACCs cause virilisation in women, while oestrogen-secreting ACCs result in male feminisation [3]. Oestrogens may stimulate proliferation in adrenal cortex via autocrine/paracrine mechanisms; higher levels of the oestrogen receptor-1 (ESR1, Era) are reported in ACCs, with the opposite effect for the oestrogen receptor-2 (ESR2, Erb). As a result, adrenocortical carcinomas show an elevated ER1/ER2 (ERα/ERβ) ratio [102]. Another study has associated the increase in this ratio with raised expression of a receptor for another sex hormone: progesterone (PGR) [103]. Moreover, the nuclear hormone receptor, namely oestrogen-related receptor-α (ESRRA, or ERRa), shows elevated concentrations in ACCs compared with normal tissue and other adrenocortical tumours [104]. Furthermore, ACCs reveal an increase in expression of aromatase (CYP19A1), the enzyme synthesising oestrogen [102].

Retinoic acid pathway

Retinoids are generally involved in proliferation, differentiation, and apoptosis. A number of studies report the decreased expression in ACCs of retinoid X receptor-α (RXRA), retinoic acid receptor responder (tazarotene induced) 2 (RARRES2), and aldehyde dehydrogenase 1 family, members Al and A3 (ALDH1A1 and ALDH1A3) [21, 31, 32,52, 83, 85, 90, 92, 94].

Genetic/familial syndromes

In the majority of cases familial cancer syndromes originate from a specific underlying molecular profile with germlme mutations, which may be as simple as a point mutation, but more often are complex alterations affecting multiple genes and molecular pathways [38]. Adrenocortical tumours occur in the course of a number of familial disorders, such as: Li-Fraumeni syndrome (LFS), Beckwith-Wiedemann syndrome (BWS), Carney complex (CNC), multiple endocrine neoplasia (MEN1), McCune-Albright syndrome (MAS), and familial adenomatous polyposis coli (FAP) with its variant Gardner syndrome (familial colorectal polyposis) – which are summarised in Table I [105, 106]. The focus of this review is the adrenocortical carcinoma, and consequently the syndromes characterised by increased prevalence of this kind of cancer are described in detail.

Li-Fraumeni syndrome

Inherited in an autosomal dominant manner, Li-Fraumeni syndrome (OMIM 151623) is characterised by multiple types of early onset non-site specific neoplasms, occurring in patients younger than 45 years. The most prevalent are pre-menopausal breast cancer, soft-tissue sarcoma, brain tumours, osteosarcoma, adrenocortical carcinoma, and lung carcinoma, with leukaemia as the least frequent neoplasm of this group (data obtained from IARC TP53 Database) [42, 107, 108]. ACC develops in less than 10% of TFS-patients and, compared with the other neoplasms mentioned, is diagnosed in the youngest patients in early childhood [41, 42, 109].

Most patients with Ti-Fraumeni (TFS) or Li-Fraumeni-like (TFT) syndromes carry heterozygous mutations in the TP53 gene (17p13.1), encoding the p53 tumour suppressor protein, also called the ‘guardian of the genome’. The p53 transcription factor acts by activating the expression of genes involved in: cell cycle control, arrest in G1 phase in case of DNA damage (maintenance of genomic stability), and apoptosis [110]. There is much variation in the reported incidence of mutations in the TP53 gene in TFS/TFT patients – being around 80% and 40%, respectively [111], or almost 30% as a combined value for both syndromes [112]. For all familial tumour cases in general, up to 17% are reported to be the effect of alterations in the TP53 gene [109]. It is worth noting that, in line with the Chompret criteria for TFS, every single patient with ACC, regardless of their age at diagnosis or family history, demonstrates a high probability (usually 50-80%) of having a germ line mutation in TP53 [109, 113]. According to the International Agency for Research on Cancer (IARC), TFS-related mutations concentrate in TP53 in exons 5-8 (around 80-90%) and then in exons 4 and 10 (below 10% altogether), most of them being missense (almost 70%), followed by splicing (10%), nonsense (9%), and frame-shift (7%) changes [42].

Two main functions of p53 are affected by alterations in those regions: the DNA contact via DNA binding domain (DBD) and the support of the structure of protein-DNA contact surface, obtained by two large loops (L2 and L3), stabilised by zinc binding and a loop-sheet-helix motif (loop LI). Consequently, the mutant proteins are divided into two groups: „contact” (results of mutations, such as S241F, R248W, and C277F) and „structural” (R175H, C176F, H179R, and C242F). Other suggested mechanisms for altered p53 functioning include: gain-of-function (GOF) and dominant-negative effects (DNE) over the wild-type protein, when no selective pressure is exerted for the loss of the wild-type allele [113, 114].

Studies of individuals from Southern Brazil with family history compliant with the clinical definitions of LFS or LFL syndrome have shown that around 13% of them are carriers of the C.1010G > A (p.R337H) mutation in exon 10 of TP53 gene [112]. Despite the previous alternative theories, a recent study has confirmed that the high prevalence of this mutation, around 0.3% in the population of this region, results from the occurrence of a founder effect in the Brazilian population, hr Southern Brazil the incidence of childhood ACC is 10-15 higher compared with other parts of the world, being strongly associated with the p.R337H mutation [115-117].

A small number of the families afflicted with LFS carry a mutation in another gene – CHEK2 (22q12.1); this has led to its renaming as Li-Fraunreni Syndrome 2 (LFS2) (OMIM 609265) [41, 118]. There is also the LFS3 (OMIM 609266), associated with the region 1q23, which requires further investigation [118, 119].

Beckwith-Wiedemann syndrome

Beckwith-Wiedenrann syndrome (OMIM 130650) is a rare imprinting disorder, mostly sporadic with familial cases representing less than 15% of cases. This paediatric syndrome is predominantly characterised by anterior abdominal wall defects, macroglossia, and overgrowth. Around 10% of Beckwith-Wiedemann cases are associated with an increased risk of tumour development, the most frequent being Wilms tumours, hepatoblastomas, rhabdomyosarcomas, and adrenocortical tumours [120, 121]. Genetically, Beckwith-Wiedemann syndrome is caused by altered expression of imprinted genes in the region 11p15.4-p15.5. The telomeric domain (called imprinting centre 1, IC1 or differentially methylated region 1, DMR1) contains IGF2 and H19 genes. The centromeric domain 2 (IC2, DMR2) comprises around 10 imprinted genes, encoding the cyclin-dependent kinase inhibitor p57KIP2 (cyclin-dependent kinase inhibitor 1C gene, CDKN1C or p57kip2), a subunit of a potassium voltage-gated channel (KCNQ1), and its overlapping transcript (KCNQIOT1 or LIT1) [120,122].

The majority of BWS-related genetic defects are due to the loss of imprinting, caused by abnormal methylation in the IC2, whilst most familial cases are associated with alterations in CDKN1C gene or microdeletions along IC1, presenting an autosomal dominant pattern of inheritance [121, 123]. Another gene implicated in the development of Beckwith-Wiedemann syndrome is NSD1 (5q35.2-q35.3). Baujat et al. described its mutations in a small number of BWS patients and suggested the possible influence of the product of this gene, the nuclear receptor binding SET domain protein 1, on the imprinting in the 11p15 region. It acts also as a coregulator of the androgen receptor [124].

Multiple endocrine neoplasia type 1

Multiple endocrine neoplasia type 1 (OMIM 131100) is a highly penetrant, autosomal dominant condition, presenting with tumours of the parathyroid glands, endocrine pancreas, anterior pituitary gland, thymus (carcinoids), thyroid (adenomas), and, in up to 40% of patients, adrenocortical neoplasm or hyperplasia. ACCs occur but are extremely rare. The majority of affected families (75-95%) have a heterozygous inactivating germline mutation in the MEN1 gene (11q13.1) [125, 126], but major deletions are also seen. The menin protein is a tissue-specific tumour suppressor and has been reported to interact with a variety of proteins such as: transcriptional factors (e.g. Jun D, NFκB and Smad3) or histone H3 methyltransferases (e.g. MLL, MLL2) [127]. Consequently, its field of action is the regulation of cell cycle, proliferation, and apoptosis [128]. The impact of menin on cellular growth seems to be quite complex, as it acts as a suppressor in endocrine cells and as an activator in certain types of leukaemia cells [127].

Familial adenomatous polyposis 1

Familial adenomatous polyposis (FAP) 1 and its variant Gardner syndrome (OMIM 175100) are autosomal dominant disorders. In its typical form, FAP manifests as hundreds to thousands of colorectal adenomatous polyps and cancer [129]. while Gardner syndrome reveals gastrointestinal polyposis and other lesions, such as osteomas, epidermoid cysts, hepatoblastoma, papillary or follicular thyroid cancer, and adrenal adenomas [130]. The molecular cause underlying these syndromes is found at the locus 5q22.2, containing the adenomatous polyposis coli (APC) gene, which acts as a tumour suppressor by decreasing the activity of β-catenin. In the absence of the regulating effect of APC, nuclear β-catenin accumulation leads to up-regulation of genes involved in the cell cycle entry and progression. The pathogenic alterations in APC gene are mainly frame-shift or nonsense mutations, then large gene deletions and splice site changes [129]. It was observed that FAP patients show increased risk for the ACC formation, compared with the general population. That may be explained by the fact that increased levels of β-catenin possibly play role in the ACC development, as this protein potently activates a spectrum of genes essential for adrenocortical tissue development and homeostasis [131, 132].

Promising therapeutic targets in adrenocortical cancer

Mentioned above as the cascades involved in cross talk and regulation by a number of factors of the cell signalling system, PI3K/Akt/mTOR and Ras/Raf/MEK/ERK pathways are both initiated by TKR activation. Recent reports have identified a number of their elements as promising targets for ACC therapy, along with studies demonstrating the anti-proliferative activity of PI3K/mTOR inhibitors in adrenocortical cancer cells [99, 133-141].

Fassnacht et al. described elevated total Akt protein expression in ACCs, but not in ACAs or normal tissue. This research group also assessed the level of phosphorylated Akt (pAkt) and showed that in fact the pAkt/Akt ratio was not altered in carcinomas [142]. However, another study reported that expression of pAkt was higher in ACCs [34]. Additionally, mTOR, phospho-mTOR, and raptor protein levels were markedly increased in adrenocortical tumours. Accordingly, mTOR activity was higher in ACTs than in controls. On the other hand, RICTOR was not detectable in tumour or normal adrenal tissue [99].

A few reports regarding Ras proteins describe overexpression of KRAS rnRNA and mutations in KRAS gene in benign adrenal alterations [143] and carcinomas [82] as well as mutations in NRAS gene in both ACCs and ACAs [82, 144]. However, some other studies have reported a lack of mutation of those genes and HRAS (HRas) in adrenal neoplasms [144–146]. Moreover, Kotoula et al. found activating mutations in the BRAF gene (B-Raf) in almost 6% of carcinomas tested [82]. These observations suggest that alterations in genes encoding elements of Ras and Raf families may occur in adrenal lesions, but are not common events.

Molecular research methods

A range of susceptibility genes, found in affected individuals with a family history, were the initial candidates for determining tumour malignancy and its differentiation from benign neoplasms. Genome-wide studies such as transcriptome analysis allow us to cluster tumours that follow similar molecular and prognostic profiles. It may represent a real turning point in adrenocortical tumour diagnosis and treatment.

The methods enabling these analyses include: microsatellite analysis, conventional and array-based comparative genomic hybridisation (CGH), cDNA, oligonucleotide, SNP, miRNA microarrays, and PCR arrays. A number of research groups have carried out experiments on the expression of a large number of genes in adrenocortical tumours. While studies using microsatellite markers identify genomic regions of high concentration of TOH [35, 125], conventional comparative genomic hybridisation assesses copy number alterations across the entire genome [25, 147-152]. However, the main disadvantage of conventional CGH is its limited resolution (2 Mbp for amplifications and 10-20 Mbp for single-copy deletions), making it an unreliable method to detect changes at the locus level. This has been addressed by CGH arrays, which allow the detection of DNA copy number aberrations at the gene level, locus by locus [153]. A number of recent studies have reported the results of the CGH array-based experiments for adrenocortical tumours [20, 46, 147, 154].

Other types of DNA microarrays used in ACT research are cDNA, oligonucleotide, and SNP microarrays. The first two form the basis of expression profiling studies, differing slightly in precision and reliability. The volume of research reports based on microarrays ‘spotted’ with cDNA probes [31, 37, 83, 85, 91, 155, 156] is comparable to the number of studies using Asymetrix GeneChips (high-density oligonucleotide microarrays) [19, 21, 32, 33, 52, 92, 94, 157-160]. A few recent reports have focused on single nucleotide polymorphism (SNP) analysis of adrenocortical tumours employing SNP arrays [73, 161, 162]. SNP microarrays enable the detection of copy number variations and TOH in the samples. Another type of specifically-designed chip is microRNA microarray, allowing the genome-wide investigation of miRNA populations [90, 96-98, 100]. Microarray technology also allows methylation profiling studies, suggesting that it may be another means of differentiating malignant from benign neoplasms [163-165]. As for PCR arrays, they are a method of choice for studies oriented on a specific group of genes, for example implicated in a specific cellsignalling cascade [155, 166, 167].

The techniques used to validate the results of a genome-wide study for chosen samples include immunohistochemistry, Western blotting, qPCR, and fluorescence in situ hybridisation (FISH). Apart from transcriptome analyses, one of the most common methods to screen a large number of samples is tissue microarray: it has been widely used for immunohistochemistry studies on adrenocortical tumours [21, 34, 51, 52, 67, 69, 80, 168].

Selected targeted therapies in adrenocortical cancer

Recent developments in the understanding of molecular mechanisms underlying ACC have led to clinical trials of targeted therapies; however, the results are still unsatisfactory. Reports on salvage therapies with the use of agents targeting specific molecules remain even more pessimistic. However, it should be noted that these treatments were used in ACC patients who initially showed very poor prognosis due to advanced stage of disease and who failed to respond to prior chemotherapy.

As discussed above, an increase of IGF2 gene expression was observed in the majority of ACC cases [21, 24, 26, 31-36]. Overexpression of IGF1R is also thought to play a role in the pathogenesis of ACC [34, 36], but it seems to be primarily an indicator for paediatric ACCs [39, 40]. Promising pre-clinical data of anti-proliferative effects of IGF1R inhibition in ACC [34] provided the basis for phase I trials of IGF1R inhibitors. The anti-IGFIR monoclonal antibody figitumumab has demonstrated biological activity in refractory ACC [169]. Another phase I trial assessed a combination of IGF1R inhibitor cixutumumab with mTOR inhibitor temsirolimus in metastatic ACC patients. Eleven of 26 enrolled patients (42%) achieved stable disease for six months, demonstrating biological activity of this regimen in metastatic ACC [170]. Disappointingly, a multi-centre, randomised phase II trial in patients with irresectable recurrent/metastatic ACC assessing the efficacy of cixutumumab combination with mitotane failed to prove clinical benefit as a first-line therapy. It proved to be efficient in some patient subgroups, but overall showed relatively low therapeutic efficacy, which prevents this regimen from proceedingin further studies [171]. Another IGF1R inhibitor to present potential anti-tumour ability in preliminary studies and further undergo a clinical trial was Linsitinib (OSI-906). However, in a double-blind, randomised, phase 3 study in patients with locally advanced or metastatic ACC Linsitinib did not improve overall survival, failing to present efficacy for this type of cancer [172].

With mTOR being a downstream effector of the IGF2 signalling pathway, its inhibitor everolimus (rapamydn derivative) might have therapeutic potential in ACC patients. In vitro studies demonstrated that everolimus exerts an inhibitory effect on ACC cell proliferation [99, 134, 173, 174]. However, a study, which enrolled four women with advanced ACC, demonstrated no clinically meaningful response to everolimus. This cohort included patients who developed stage IV disease after surgery and progressed despite treatment with mitotane and other modalities including chemotherapy, thalidomide, and IGF1R antagonist. Everolimus was added to the treatment (two out of four patients also continued mitotane) but did not prevent disease progression in any of the patients [175].

EGFR was found to be a malignancy marker for adrenal tumours [80]; however, the EGFR mutations in exons 18-21 were observed in up to 11% of ACC cases [82, 176]. Erlotinib is an EGFR-spedfic tyrosine kinase inhibitor that is FDA approved for the treatment of NSCLC. Pre-clinical results of erlotinib in ACC cell lines and primary cultures are promising [177-179]. The efficacy of combined treatment with erlotinib and gemcitabine as salvage therapy was assessed in the group of patients with progressive ACC after two to four previous systemic therapies. Only one in 10 patients experienced a minor response, whereas eight patients progressed, suggesting that salvage chemotherapy using this regimen has no benefit in patients with very advanced ACC [180].

Summary, final conclusions, and future opportunities

The molecular studies of aberrations of signalling pathways in adrenocortical tumours have revealed a spectrum of underlying alterations both at the DNA sequence and expression levels. Many of these changes are differentially present in adrenocortical carcinomas and adenomas, thus providing diagnostic utility by defining a malignancy signature. The pipeline of diagnostic markers includes proliferation assessment by Ki-67 labelling index [181]. Similarly, steroidogenic factor-1 shows great diagnostic and prognostic value, as its increased expression correlates with more advanced tumour stage and poorer prognosis [68]. Other examples of molecular events that may be potentially used for this purpose include increased levels of insulin-like growth factor II, fibroblast growth factor receptors 1 and 4, or cyclins (D1, E1, and E2). However, their usage in clinical practice needs to be carefully formulated and validated. In addition, altered genes, miRNAs, and/or proteins are prospective targets for a more personalised therapy of ACC.

Further investigation may lead to the development of novel treatment options, which may replace the highly damaging regimen of choice in the case of metastasis or recurrence despite the surgery, namely mitotane as a single agent or combined with cytotoxic drugs. A number of agents seem to be promising in ACC treatment, such as IGFIR antagonists (NVPAEW541, IMC-A12, figitumumab (CP-751,871), OSI-906), β-catenin antagonists (PKF115-584), SF-1 inverse agonists (compounds of the isoquinolinone class), and mTOR antagonists (rapamydn, sirolimus, and its derivatives everolimus (RAD001) and temsirolimus) [13, 182]. However, single-agent therapy alone, as for everolimus, may not be sufficient for malignant adrenocortical tumours, and negative interactions with other therapies such as mitotane need to be taken into account [175].

In summary, enhancing the understanding of the molecular events of adrenocortical tumourigenesis, especially with regard to the signalling pathways, may greatly contribute to improving a range of available diagnostic, prognostic, and treatment approaches.

Acknowledgements

Dr Dorota Dworakowska was supported by Foundation for Polish Science within the grant ‘Bridge’ (POMOST/2012-5/3), which is co-financed by European Union within Regional Development Programme. Paulina Szyszka was a PhD student to Dr Dworakowska within the frame of this grant.

---

Polish version

Wstęp

Guzy kory nadnercza (ACT, adrenocortical tumours) są dość rozpowszechnionymi nowotworami, a częstość ich występowania zwiększa się wraz z wiekiem pacjenta. Incydentalomy nadnercza wykrywa się podczas wykonywania około 4% badań CT (computed tomography) i 6% autopsji, prawdopodobnie jest ich jednak znacznie więcej. Aczkolwiek większość ACT to niefunkcjonalne gruczolaki kory nadnercza (ACA, adrenocortical adenomas), zdarzają się też przypadki gruczolaków funkcjonalnych związanych z hiperkortyzolemią i/lub hiperaldosteronizmem [1, 2]. Z drugiej strony, postać złośliwa, rak kory nadnercza (ACC, adrenocortical carcinoma), występuje rzadko z roczną zapadalnością na poziomie 0,5-2 na milion mieszkańców [3] i 0,3 na milion w przypadku dzieci poniżej 15. roku życia [4]. Zazwyczaj ACC rozwija się w dzieciństwie (przed 5. rokiem życia) lub w czwartej i piątej dekadzie życia i jest częstszy u kobiet niż u mężczyzn [1, 5].

Rozpoznanie histopatologiczne ACC jest nadal przedmiotem kontrowersji, zaproponowano kilka sposobów punktacji, których celem jest postawienie wiarygodnej diagnozy [6-9]. Najczęściej stosowanym systemem jest skala Weissa, która jest w użytku od 1984 roku [10]. Opiera się ona na analizie histologicznej i jest ceniona ze względu na prostotę i łatwość zastosowania. Mimo to, niezbędny jest niezawodny system klasyfikacji nowotworów, umożliwiający rozróżnienie między łagodnymi i złośliwymi formami guza oraz rozpoznanie nowotworów przerzutujących najszybciej jak to jest możliwe.

Rokowanie w przypadku raka kory nadnercza jest bardzo złe, a wskaźnik 5-letnich przeżyć plasuje się na poziomie poniżej 35%. U większości pacjentów już na etapie rozpoznania nowotwór znajduje się w stadium zaawansowanym, ale ogranicza się do nadnercza i kwalifikuje się do leczenia operacyjnego. Mimo to, w około 30-40% przypadków ACC przerzuty są obecne w momencie ustalenia rozpoznania choroby, a dostępne metody leczenia rzadko umożliwiają uzyskanie całkowitej remisji [11, 12].

Pierwsza linia leczenia ACC to całkowita chirurgiczna resekcja guza, nie zapewnia ona jednak pełnego wyleczenia, gdyż pooperacyjny nawrót choroby występuje w 70-80% przypadków [13]. W celu poprawy rokowania zaleca się leczenie mitotanem, pojedynczo lub w połączeniu z chemioterapią. Mitotan traktowany jest jako pierwsza linia leczenia adjuwantowego, wydłużająca czas bez nawrotu choroby, jednak w najlepszym wypadku jedynie 24% pacjentów wykazuje obiektywną odpowiedź na leczenie [11, 14, 15]. Jako że ta strategia leczenia daje niezadowalające wyniki, niezbędne są nowe metody leczenia ACC, które poprawiłyby wskaźniki przeżywalnośd i zmniejszyłyby liczbę nawrotów choroby.

Większość przypadków ACC to przypadki sporadyczne; literatura zawiera jednak wiele opisów rodzinnych zespołów uwarunkowanych genetycznie, które charakteryzują się zwiększoną częstością występowania ACC, jak zespół Ti-Fraumeni czy Beckwitha-Wiedemanna [16]. Stąd też intensywne badania molekularne ACC, które dają wgląd w podstawy molekularne tego rodzaju nowotworów [17-24].

W pracy omówiono zmiany molekularne, które mogą odgrywać istotną rolę w rozwoju raka kory nadnercza ze szczególnym uwzględnieniem oddziaływań między genami, białkami i szlakami sygnalizacyjnymi oraz przedstawiono możliwości diagnostyczne i terapeutyczne.

Patologia molekularna raka kory nadnercza

Nasza wiedza na temat podstaw molekularnych raka kory nadnercza poprawiła się w ciągu ostatnich lat, jednak dokładne mechanizmy i interakcje między różnymi czynnikami przyczyniającymi się do rozwoju ACC nadal są niejasne. Wysokowydajne testy ekspresji genów oparte na badaniach transkryptomów, umożliwiające badanie dużej liczby genów podczas jednego eksperymentu, wykazały różnice pomiędzy guzami łagodnymi i złośliwymi, zapewniając nowe narzędzia diagnostyczne oraz wskazały możliwości ulepszenia obecnie dostępnych metod leczenia [17-24]. Średnia liczba zmian genetycznych jest znacznie wyższa dla raka kory nadnercza niż gruczolaka [17, 18, 20, 25]. Zmiany zachodzące w komórkach ACC obejmują: zmiany ekspresji, mutacje, zmienność liczby kopii oraz utratę heterozygotyczności (TOH, loss of heterozygosity). Pojawiają się one w obrębie całego genomu (ryc. 1) i są zaangażowane w wiele procesów komórkowych.

Zmiany molekularne odgrywające kluczową rolę w powstawaniu złośliwych zmian kory nadnercza to: nadekspresja IGF2 (insulinopodobnego czynnika wzrostu), mutacje inaktywujące TP53 (gen kodujący białko p53), konstytutywna aktywacja szlaku sygnalizacyjnego Wnt/β-katemna poprzez aktywujące mutacje genu β-kateniny (CTNNB1). Zmiany w kinazie białkowej A (PKA) i steroidogennym czynniku 1 (SF-1) również zaangażowane są w powstawanie raka kory nadnercza. Najnowsze badania wykazały, że opisane zmiany nie mogą być traktowane pojedynczo, jako samodzielne czynniki prowadzące do rozwoju złośliwych nowotworów nadnercza, ale zbiorowo – każda z nich może przyczynić się do rozwoju ACC wraz z innymi czynnikami współtowarzyszącymi [26, 27]. Rodzaje mutacji obserwowanych w sporadycznych ACC są bardzo podobne do tych, które wykazano w dziedzicznych nowotworach (patrz następny rozdział) i najczęściej są to mutacje zmiany sensu.

Szlak sygnałowy insulinopodobnego czynnika wzrostu 2

Insulinopodobny czynnik wzrostu 2 (IGF2, insulin-like growth factor 2) odgrywa swoją rolę poprzez wiązanie z błonowym receptorem kinazy tyrozynowej (TKR, tyrosine kinase receptor), IGF1R. Po związaniu Ugandu następuje autofosforylacja receptora i przyłączenie substrátu dla receptora insulinowego (IRS-1, insulin receptor substrate 1) [28]. Fosforylacja tyrozyny w IRS-1 aktywuje kaskadę sygnałową takich szlaków, jak PI3K/Akt/mTOR oraz Ras/Raf/MEK/ERK.

Zmiany genetyczne w locus 11p15.5 opisane w sporadycznych ACC to przede wszystkim: przegrupowania, LOH, izodisomia ojcowska i zmiany imprintingu. Zmiany te skutkują zmniejszeniem ilości mRNA p57kip2 i FI19 oraz zwiększeniem IGF2, co wiąże się z gorszym rokowaniem i zwiększonym ryzykiem nawrotu ACC [29, 30]. Jednak najczęstszą zmianą transkrypcyjną w ACC, występującą w ponad 80% przypadków, jest nadekspresja genu IGF2 [21, 24, 26, 31-36]. Zmiana ta jest charakterystyczna dla złośliwych zmian nadnercza (the adrenal-specific malignancy signature), ale nie dla ACA i niezmienionej tkanki nadnercza. Pierwszy raz opisano ją w przypadkach zespołu Beckwitha-Wiedemanna (patrz następny rozdział). Klaster IGF2 obejmuje grupę powiązanych genów, które również wykazują zwiększoną ekspresję w ACC, i zawiera głównie geny czynników wzrostu i ich receptorów [18, 37]. Klaster IGF2 zawiera również gen kodujący białko wiążące insulinopodobny czynnik wzrostu 2 (IGF-BP2, insulin-like growth factor-binding protein 2), które pełni funkcję nośnika IGF2. Jego ekspresja i poziom w osoczu korelują z masą guza w przypadkach ACC [38]. W przypadku guzów wieku dziecięcego poziom IGF2 jest podobny w obu typach guza – ACA i ACC. Różnica polega na ekspresji genu IGF1R, który wydaje się być podstawową cechą charakterystyczną złośliwych guzów kory nadnercza u dzieci [39, 40].

Szlak sygnałowy TP53

Zmiany w obrębie genu TP53 związane z ACC występują głównie w obrębie eksonu 5, tak zwanego gorącego miejsca (hot spot), ale także w eksonach 6, 7, 8 i 10 [41, 42]. Mutacje TP53 obserwowane są razem z akumulacją p53, co wykazano przy użyciu metod immunohistochemicznych [43]. Inaktywujące mutacje somatyczne TP53 należą do jednych z najczęściej obserwowanych w ACC, według szacunków występują w 15-70% przypadków [19, 44–46], a ich obecność koreluje z większymi wymiarami guza, bardziej zaawansowanym stadium, większą ilością przerzutów i skróconym czasem przeżycia wolnego od choroby [43, 47].

Szlak sygnałowy Wnt/β-katenina

Kaskada sygnałowa Wnt/β-katenina reguluje proliferację, różnicowanie, przeżywalność i apoptozę, współdziałając z innymi ścieżkami sygnalizacyjnymi: TP53, TGF, PBK/Akt/mTOR oraz Ras/Raf/MEK/ERK. W korze nadnerczy, szlak Wnt/β-katenin na bierze udział w rozwoju i różnicowaniu nadnerczy [48, 49]. Nieprawidłowe funkcjonowanie tego systemu może prowadzić do rozwoju nowotworu nadnercza. Najbardziej wyraziste skutki na poziomie molekularnym obejmują zaburzenia akumulacji β-kateniny w cytoplazmie i jądrze komórkowym oraz aktywujące mutacje somatyczne genu β-kateniny (CTNNB1). Zmiany te występują prawie wyłącznie w ACC o złym rokowaniu [19, 46, 50, 51]. Inne białko docelowe szlaku Wnt/i-kaleniny, kodowane przez gen ENC1 (ectodermal-neural cortex protein 1), jest aktywowane w raku kory nadnercza [52]. Ostatnie badania wykazały w próbkach ACA i ACC delecję 12 par zasad w regionie kodującym genu AXIN2, negatywnego regulatora szlaku Wnt/β-katenina [53].

Szlak sygnałowy cAMP/PKA

Modyfikacje podjednostki R1A kinazy białkowej A (PKA, protein kinase A), stanowiącej rdzeń szlaku cAMI) często występują wśród osób z zespołem Carneya (patrz następny rozdział). Bertherat i wsp. wykazali, że braki w loci 17q23-q24 są częste w przypadkach nowotworów kory nadnercza, częściej w ACC niż w ACA. Jednakże, mutacje genu PRKAR1A zaobserwowano w przypadkach ACA, ale nie ACC, co sugeruje odmienną rolę PKA w nowotworzeniu guzów łagodnych i złośliwych [54]. Zgodnie z tym, wadliwa ekspresja podjednostki R2B (gen PRKAR2B, 7q22.3) obserwowana jest w gruczolakach wydzielających hormony, natomiast nie jest zmieniona w rakach wydzielających i gruczolakach niewydzielających hormonów [55]. Utrata podjednostki R1A skutkuje zwiększoną sygnalizacją mTOR [56]. Kaskada ACTH/G/PKA zależna od cAMP odgrywa kluczową rolę w regulowaniu produkcji glikokortykosteroidów i androgenów. Modyfikacje genetyczne lub zmiany ekspresji genów elementów szlaku cAMP wiążące się ze zmienionym wydzieleniem i rozwojem raka kory nadnercza to:

• zmniejszenie ekspresji i LOH receptora hormonu adrenokortykotropowego (ACTH, adrenocorticotropic hormone) [57];
• defekty genetyczne w genie PDE8B fosfodiesterazy 8B [58];
• zmniejszenie ekspresji białka wiążącego element odpowiedzi na cAMP (CREB, cAMP-responswe element binding protein) [59, 60];
• wyższa aktywność telomerazy [60];
• zmniejszenie ekspresji izoform ICER (wczesnego represora indukowanego cAMP, inducible cAMP early repressor), które wywodzą się z wewnętrznego promotora genu CREM (kodujący białkowy modulator odpowiedzi na cAMP, cAMP responswe element modulator) [60].

Odmienne zmiany zaobserwowano w przypadkach ACA, co sugeruje, że powyższe zmiany mogą być wskaźnikami złośliwości nowotworu. Jednakże, większość z tych zmian związana jest z zespołem Cushinga, co sugeruje, że zmiany w sygnalizacji cAMP wykazują silną zależność z tym określonym rodzajem nowotworu kory nadnercza.

Szlak steroidogenezy

Receptor jądrowy steroidogennego czynnika 1 (SF-1, NR5A1, nuclear receptor steroidogenic factor 1) odgrywa rolę głównego regulatora różnicowania i steroidogenezy w nadnerczach poprzez kontrolę ekspresji enzymów cytochromu P450. Receptor jądrowy steroidogennego czynnika 1 jest zaangażowany w regulację proliferacji, apoptozy, angiogenezy, przyczepności oraz dynamiki cytoszkieletu komórek kory nadnerczy [61, 62]. Wysoki poziom SF-1 zwiększa proliferację komórek kory nadnerczy oraz zmniejsza wydzielanie kortyzolu i aldosteronu, za to nie wywiera on wpływu na produkcję dehydroepiandrosteronu (DHEA). Zwielokrotnienie liczby kopii genu SF-1 (NR5A1) stymuluje nowotworzenie [63]. Badania inhibitora SF-1, Pod-1 (capsulin, epicardin, Tcf21), wykazały, że gen TCF21 jest zahamowany w ACC, ale nie w ACA i normalnej tkance [64], Nadekspresja SF-1 jest o wiele bardziej znacząca w nowotworach u dzieci niż u dorosłych. W większości nowotworów wieku dziecięcego liczba kopii SF-1 jest zwiększona w wyniku posiadania dodatkowego chromosomu lub amplifikacji w 9q33 [65-67]. Receptor jądrowy steroidogennego czynnika 1 jest również przydatny jako marker rokowniczy: jego zwiększona ekspresja koreluje z bardziej zaawansowanym stadium nowotworu, gorszymi efektami leczenia i krótszym całkowitym czasem przeżycia [68, 69].

Innym czynnikiem zaangażowanym w steroidogenezę jest ACTH (hormon adrenokortyko tropowy, kortykotropina), który odgrywa kluczową rolę w maksymalizacji specyficznej ekspresji enzymów steroidogennych, które niezbędne są do syntezy glikokortykoidów i androgenów w warstwach siatkowatej (zona reticularis) i pasmowatej (zona fasciculata) nadnerczy. Hormon adrenokortykotropowy działa poprzez receptory sprzężone z białkiem Gs zwiększając poziom cAMIJ a tym samym aktywując PKA, co z kolei stymuluje ekspresję enzymów steroidogennych P450. Kaskada ACTH/Gs/PKA odgrywa zasadnicze znaczenie w utrzymaniu wysoko zróżnicowanego fenotypu nadnerczy, a jedynie umiarkowane znaczenie w proliferacji komórek [70, 71]. Rak kory nadnercza wykazuje obniżony poziom ekspresji i FOH genu ACTH-R, kodującego receptor kortykotropiny [57, 60].

Klaster genów steroidogenezy, również wykazujący zróżnicowanie pomiędzy ACC a ACA zawiera: CYP11A1 (cytochrom P450scc, desmolaza cholesterolu), CYP11B1 (P450c11B1, 11β-hydroksylaza), CYP17A1 (P450c17, 17α-hydroksylaza), CYP21A2 (P450c21, 21-hydroksylaza), HSD3B1 (dehydrogenaza 3β-hydroksysteroidowa/Δ-5-4 izomeraza) oraz STAR (StAR, białko ostrej regulacji steroidowej, steroidogenic acute regulatory protein). W przeciwieństwie do ekspresji klastra IGF2, klaster genów steroidogenezy wykazuje niską ekspresję w raku kory nadnercza, a wysoką w gruczolaku. Jest to zgodne z zaobserwowaną zwiększoną produkcją glukokortykoidów w ACA [37]. Związek między szlakami IGF2 i steroidogenezy jest widoczny zwłaszcza w okresie rozwoju i różnicowania nadnerczy. Insulinopodobny czynnik wzrostu 2 pobudza ekspresję enzymów steroidogennych regulowanych przez ACTH, takich jak P450scc, P450cl7 i HSD3B1 [29]. Ostatnie badania wskazują również związek z kaskadami TGFβ i Wnt/β-katenina. Jednakże dokładne mechanizmy tych współzależności nie zostały jeszcze zidentyfikowane [62, 72]. Proponowane wytłumaczenie wskazuje udział białka docelowego szlaku Wnt/β-kalenina, SGK1 (kinazy 1 regulowanej przez osocze i glikokortykoidy, serum and glucocorticoid-regulated kinase 1), która wykazuje obniżoną ekspresję w raku kory nadnercza. Kinazą serynowo-treoninową jest SGK1, która jest regulowana przez takie czynniki, jak kortykosteroidy, czynniki wzrostu, białko p53 i mTORC2 [73].

Inne czynniki wzrostu i ich receptory

Poza IGF2 kilka innych czynników wzrostu odgrywa rolę w rozwoju nowotworów kory nadnercza, wskazując na istnienie sieci współzależności szlaków sygnalizacji komórkowej. Czynniki regulujące mTOR, które zaangażowane są w rozwój ACC to: czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF, vascular endothelial growth factor), epidermalny czynnik wzrostu (EGF, epidemial growth factor) oraz IGF2. Ponadto, mTOR może wpływać na ekspresję IGF2 i VEGF, odgrywając rolę ich stymulatora [74]. Wśród różnych typów nowotworów nadnercza najwyższy poziom VEGF zaobserwowano w ACC. Jednym z głównych czynników angiogenezy w guzach litych jest VEGF [75-77]. Zwiększony poziom VEGF wykazuje silną zależność z nadekspresją IGF2, zgodnie z obserwowanym wpływem na auto- i parakrynną regulację wzrostu komórek nowotworowych [77].

Również receptor epidermalnego czynnika wzrostu (EGFR, epidemial growth factor receptor) wykazuje zwiększony poziom w raku kory nadnercza [78-81]. Potencjalnym markerem złośliwości jest EGFR, ponieważ jego ekspresja jest znacząco wyższa w ACC niż w ACA. Receptor EGF, należący do rodziny ErbB, bierze udział w proliferacji i przeżyciu komórek. Docelowymi szlakami sygnałowymi są Ras/Raf/MEK i STAT [81]. Kotoula i wsp. przeprowadzili badania mutacji w genie EGFR i wykryli je w domenie kinazy tyrozynowej tego receptora w stosunkowo niewielkiej ilości (11%) raków [82].

Receptory czynników wzrostu fibroblastów (FGFR1 i FGFR4) mogą również służyć jako znaczniki złośliwości, ponieważ ich stężenie jest znacznie wyższe w ACC niż w ACA i tkance zdrowej [33, 37, 46, 52, 83-85]. Współdziałają one z IGF2 (hamowanie poprzez podstawowy FGF2) i NRAS, bezpośrednie białko docelowe sygnalizacji FGFR. FGFR1 i FGFR4 należą do genów klastra IGF2, a ich nadmierna ekspresja koreluje bezpośrednio z IGF2 [33].

Transformujące czynniki wzrostu α (TGFα) β (TGFβ1 i TGFβ2) są wytwarzane w zdrowych komórkach kory nadnerczy, aby kontrolować steroidogenezę poprzez hamowanie ekspresji STAR (kodującego białko ostrej regulacji steroidowej), CYP17A1 i innych genów [79, 86]. Te dwa czynniki wzrostu dzielą te same receptory, typu 1 i 2. Nadmierna ekspresja genów TGFβ2 i TGFβR1 została zaobserwowana w ACC, ale nie w ACA, co sugeruje, że mogą one stanowić obiecujące markery złośliwości. Z drugiej strony, ekspresja TGFβR3 (kodującego betaglikan, receptor typu 3 transformującego czynnika wzrostu β) jest znacznie wyższa w ACA w porównaniu z ACC. Do klastra IGF2 należą TGFβ2 i TGFβR1, a TGFβR3 jest elementem klastra genów steroidogenezy [37].

Należące do nadrodziny TGFβ, aktywiny i inhibiny to ściśle związane ze sobą kompleksy białkowe o strukturze opartej na wspólnych elementach, ale wywierające praktycznie przeciwny skutek. Inhibina składa się z podjednostki α i β, która ma dwa warianty βA i βB, i jest eksprymowana w jajniku, jądrach, łożysku, korze nadnerczy, czyli w tkankach steroidogennych. Aktywina zawiera dwie podjednostki β (βA, βB, βC, βE) i wykazuje bardziej powszechne występowanie w tkankach, wywierając działanie hamujące na wzrost komórek kory nadnerczy i wytwarzanie steroidów, ale stymulując apoptozę w nadnerczach płodowych. Rolą inhibiny jest pośrednia regulacja produkcji steroidów poprzez blokowanie wiązania aktywin z ich receptorami [87]. Profile ekspresji INHA (podjednostka β inhibiny), INHBA (podjednostka βA inhibiny), ACVR2A (receptor aktywiny typu IIA), ACYR2B (receptor aktywiny typu IIB) oraz FST (folistatyna, białko wiążące aktywiny) wydają się podobne do TGIβR3, z ekspresją obniżoną w ACC 1 podwyższoną w ACA [37, 88]. Jednakże większość ACT wykazuje ekspresję INHA, co można wykorzystać jako marker odróżniający je od guzów niepochodzących z kory nadnercza. Wśród nowotworów wieku dziecięcego dominują ACT charakteryzujące się sporadycznymi stratami chromosomowymi w genie INHA [89].

Cykl komórkowy

Białka zaangażowane w przejście komórki z fazy G1 do S, które wykazują nadeskpresję w raku kory nadnercza to: cykliny D1 (gen CCND1), E1 (CCNE1) i E2 (CCNE2), kinazy zależne od cyklin 1 (CDK1, wcześniej CDC2), 2 (CDK2) i 4 (CDK4) oraz inhibitor kinaz zależnych od cyklin 3 (fosfataza o podwójnej specyficzności związana z CDK2) (CDKN3) [21, 46, 52, 90-93]. Wśród białek przejścia G2/M, nadmierną ekspresję wykazują cykliny A2 (CCNA2), BI (CCNB1) i B2 (CCNB2), kinazy zależne od cyklin 1 (CDK1) i 7 (CDK7), fosfataza CDC25C i topoizornerazy DNA I (TOPI) i II α (TOP2A) [21, 52, 90-92, 94]. W porównaniu z ACA i zdrową tkanką, ACC wykazują również obniżoną ekspresję inhibitorów kinaz zależnych od cyklin 1C (p57, Kip2) (CDKN1C) [33, 52, 93] i 2A (p16) (CDKN2A) [37, 46], a także protoonkogenu jun (JUN) [91] oraz reprimo, kandydata na mediatora zatrzymania w fazie G2 zależnego od TP53 (RPRM) [90]. Białka p57, p16 i jun są zaangażowane w przejście G1/S, natomiast reprimo w G2/M.

MikroRNA

MikroRNA to małe cząsteczki niekodującego RNA o dlugośd 20-22 nukleotydów, które działają na poziomie transkrypcji, regulując ekspresję genów w sposób specyficzny dla sekwencji. Są one zaburzone w wielu rodzajach raka, co sugeruje, że biorą udział w powstawaniu nowotworów [95]. Jednym z najintensywniej badanych miRNA jest hsa-miR-483-5p. Jest ono nadregulowane w ACC, w przeciwieństwie do ACA i tkanki zdrowej, i wiąże się z gorszym rokowaniem [96-98]. MiR-483-5p znajduje się w locus 11p15.5 w IGF2, który jest najczęściej nadeksprymowanym genem w ACC [97]. W związku z tym poziom miR-483-5p może być wykorzystany jako wskaźnik poziomu IGF2 w ACT, co może być przydatne przy podejmowaniu decyzji o rodzaju leczenia u pacjenta i w badaniach klinicznych środków terapeutycznych celowanych w szlaki sygnałowe związane z IGF2. Kolejny mikroRNA eksprymowany z tego samego intronu 2 genu IGF2, ale wywodzący się z ramienia 3’ prekursora miR-483, nazwany został hsa-miR-483-3p i również wykazuje podobny profil w ACC [97, 98]. W dziecięcych nowotworach kory nadnercza zaobserwowano nadekspresję miR-483-3p, ale nie miR-483-5p [99].

Inne mikroRNA o zwiększonej ekspresji w ACC to hsa-miR-139-5p (11q13.4), hsa-miR-181b (1q32.1), hsa-miR-184 (15q25.1), hsa-miR-210 (11p15.5) oraz hsa-miR-503 (Xq26.3) [90, 96, 98, 99]. Z drugiej strony, do rniRNA o obniżonej ekspresji w ACC należą hsa-miR-7 (9q21.32), has-miR-99a (21q21.1)/hsamiR-100 (11q24.1), hsa-miR-195 (17p13.1), hsa-miR-214 (1q24.3), hsa-miR-222 (Xp11.3), hsa-miR-335 (7q32.2) i hsa-miR-375 (2q35) [90, 96-100]. Aktywność mikroRNA może wywierać wpływ na szereg kaskad przekazywania sygnałów w komórce. Na przykład, miR-184, miR-7, miR-99a i miR-100 regulują na wielu poziomach szlak PI3K/Akt/mTOR, podczas gdy miR-335 i miR-375 mają wpływ na sygnalizację Wnt. Ponadto, miR-503 i miR-195 są zaangażowane w regulację cyklu komórkowego na poziomie przejścia G1/S [95, 99]. Niedawne badania przeprowadzone przez Caramutę i wsp. były pierwszymi mającymi na celu zbadanie elementów szlaku biogenezy mikroRNA. Wyniki wskazały zestaw genów wykazujących wyższą ekspresję w ACC w porównaniu z ACA i zdrowej tkanki: TARBP2 (białko 2 wiążące TAR RNA), DICER1 (dicer 1, rybonukleaza typu III) oraz DROSHA (drosha, rybonukleaza typu III), które stanowią kluczowe czynniki przetwarzania miRNA [101].

Receptory hormonów steroidowych

Steroidy płciowe (estrogeny i androgeny) odgrywają kluczową rolę w etiologii i rozwoju nowotworów piersi, jajnika i prostaty, związanych z układem hormonalnym [102]. Objawowo, ACC wydzielające androgeny powodują wirylizację u kobiet, podczas gdy ACC wydzielające estrogeny skutkują feminizacją u mężczyzn [3]. Estrogeny mogą stymulować proliferację komórek kory nadnerczy poprzez mechanizmy auto- i parakrynne. W ACC zaobserwowano zwiększony poziom receptora estrogenowego typu 1 (ESR1, Era), a obniżony receptora estrogenowego typu 2 (ESR2, Erb). W rezultacie, rak kory nadnercza wykazuje podwyższony stosunek ER1/ER2 (ERα/ERβ) [102]. Inne badania udowodniły związek między tym wskaźnikiem a zwiększoną ekspresją receptora innego hormonu płciowego, progesteronu (PGR) [103]. Ponadto, jądrowy receptor hormonów, receptora związany z estrogenami (ESRRA lub ERRa) wykazuje podwyższony poziom w ACC w porównaniu z normalną tkanką i innymi nowotworami kory nadnercza [104]. Wzrost ekspresji aromatazy (CYP19A1), enzymu syntezy estrogenów ujawniają też ACC [102].

Szlak kwasu retinowego

Retinoidy biorą przede wszystkim udział w proliferacji, różnicowaniu i apoptozie. Wiele badań wskazuje, że ACC charakteryzuje się zmniejszoną ekspresją receptora kwasu retinoidowego (RXRA, retinoid X receptor-α), RARRES2 (retinoic acid receptor responder (tazarotene induced) 2) i rodziny dehydrogenaz aldehydowych 1, A1 i A3 (ALDH1A1 i ALDH1A3) [21, 31, 32, 52, 83, 85, 90, 92, 94].

Genetyczne/rodzinne zespoły nowotworowe

W większości przypadków rodzinne zespoły nowotworowe wywodzą się z określonego profilu molekularnego z mutacjami linii zarodkowej, które mogą być mutacjami punktowymi, ale częściej są to złożone zmiany, dotykające wielu genów i szlaków molekularnych [38]. Guzy kory nadnercza występują w przypadkach wielu zaburzeń rodzinnych, takich jak: zespół Li-Fraumeni (LFS, Li-Praumeni syndrome), zespół Beckwitha-Wiedemanna (BWS, Beckwith-Wiedemann syndrome), zespół Carneya (CNC, Carney complex), mnoga gruczolakowatość wewnątrzwydzielnicza (MEN1, multiple endocrine neoplasia), zespół McCune’a-Albrighta (MAS, McCune-Albright syndrome) i rodzinna polipowatość gruczolakowata (FXP, familial adenomatous polyposis coli) z jej wariantem zespołem Gardnera (rodzinną polipowatością jelita grubego), co podsumowano w tabeli I [105, 106]. Punktem centralnym tego artykułu poglądowego jest rak kory nadnercza i w związku z tym szczegółowo opisano zespoły charakteryzujące się zwiększoną częstością występowania tego rodzaju nowotworu.

Zespół Li-Fraumeni

Dziedziczony w sposób autosomalny dominujący, zespół Li-Fraumeni (OMIM 151623) charakteryzuje się występowaniem wielu rodzajów nowotworów u pacjentów poniżej 45. roku życia. Do najczęstszych guzów należą: przedmenopauzalny rak piersi, mięsaki tkanek miękkich, guzy mózgu, kostniakomięsaki, rak kory nadnercza, rak płuc oraz białaczka (występująca najrzadziej spośród wymienionych typów) (dane uzyskane z bazy danych IARC TP53) [42, 107, 108]. W porównaniu z innymi wymienionymi nowotworami ACC rozwija się u mniej niż 10% pacjentów z LFS, ale występuje w najmłodszym wieku we wczesnym dzieciństwie [41, 42, 109].

Większość pacjentów z zespołem Li-Fraumeni (LFS) lub Li-Fraumeni-podobnym (LFL, Li-Fraumeni-like) posiada heterozygotyczne mutacje w genie TP53 (17p13.1), kodującym białko p53, zwane również „strażnikiem genomu”. Czynnik transkrypcyjny p53 działa poprzez aktywację ekspresji genów zaangażowanych w kontrolę cyklu komórkowego, zatrzymanie w fazie G1 w przypadku uszkodzenia DNA (utrzymanie stabilności genomowej) oraz apoptozę [110]. Częstość mutacji w genie TP53 u pacjentów z LFS/LFL jest dość zróżnicowana, wynosząc, odpowiednio, około 80% i 40% [111] i prawie 30% dla obu zespołów równocześnie [112]. Dla wszystkich rodzajów rodzinnych zespołów nowotworowych łącznie prawie 17% jest skutkiem zmian w genie TP53 [109]. Warto zauważyć, że zgodnie z kryteriami Chompret dla LFS, każdy pacjent z ACC, niezależnie od wieku w momencie rozpoznania czy historii rodzinnej, wykazuje wysokie prawdopodobieństwo (zwykle między 50-80%) posiadania mutacji linii zarodkowej w TP53 [109, 113]. Według Międzynarodowej Agencji Badań nad Rakiem (IARC, International Agency for Research on Cancer) mutacje związane z LFS koncentrują się w TP53 w eksonach 5-8 (ok. 80-90%), a następnie w eksonach 4 i 10 (< 10% łącznie), większość z nich to mutacje zmiany sensu (prawie 70%), a następnie „spliringowe” (10%), nonsensowne (9%) i przesuwające ramkę odczytu (7%) [42].

Dwie główne funkcje p53 zostają zaburzone w wyniku zmian w tych dwóch regionach: domenie kontaktu z DNA i wiążącej DNA (DBD, DNA binding domain) oraz podporze struktury powierzchni kontaktu białko-DNA, uzyskanej dzięki dwom dużym pętlom (L2 i L3), co jest stabilizowane wiązaniem cynku i motywem pętla-kartka-helisa (pętla LI). W związku z tym, zmutowane białka podzielono na dwie grupy: „kontaktowe” (powstałe w wyniku mutacji, takich jak S241F, R248W i C277F) i „strukturalne” (R175H, C176F, H179R, i C242F). Inne proponowane mechanizmy zaburzonego funkcjonowania p53 obejmują: mutacje nabycia funkcji (GOF, gain-of-function) oraz dominujące negatywne (DNE, dominant-negative effects) w porównaniu z białkami typu dzikiego (wild-type), gdy brak jest presji selekcyjnej po utracie allelu typu dzikiego [113, 114].

Badania mieszkańców południowej Brazylii z historią rodzinną zgodną z kliniczną definicją LFS lub LFL wykazały, że około 13% z nich jest nosicielami mutacji C.1010G > A (p.R337H) w eksonie 10 genu TP53 [112]. Pomimo wcześniejszych alternatywnych teorii, ostatnie badania potwierdzają, że wysoki współczynnik występowania tej mutacji u około 0,3% populacji tego regionu wynika z wystąpienia efektu założyciela w populacji Brazylii. W południowej Brazylii częstość występowania ACC u dzieci jest 10-15-krotnie wyższa niż w innych częściach świata i jest silnie związana z mutacją p.R337H [115-117].

Niewielka liczba rodzin dotkniętych LFS posiada mutację w innym genie – CHEK2 (22q12.1), przez co wyodrębniono zespół Li-Fraumeni 2 (LFS2) (OMIM 609265) [41, 118]. Opisano również LFS3 (OMIM 609266), związany ze zmianami w regionie 1q23, który wymaga dalszych badań [118, 119].

Zespół Beckwitha-Wiedemanna

Zespół Beckwitha-Wiedemanna (OMIM 130650) jest rzadkim schorzeniem związanym z zaburzeniami imprintingu genomowego, zazwyczaj występującym sporadycznie – rodzinne przypadki stanowią mniej niż 15% przypadków. Ten dziecięcy zespół głównie charakteryzuje się wadami przedniej ściany jamy brzusznej, makroglosją i przerostem tkanek. Około 10% przypadków BWS wiąże się ze zwiększonym ryzykiem rozwoju nowotworów, najczęściej guzów Wilmsa, hepatoblastomy, mięsaka prążkowanokomórkowego oraz guzów nadnercza [120, 121]. Z genetycznego punktu widzenia, BWS jest spowodowany przez zmiany ekspresji genów w regionie 11p15.4-p15.5 z nałożonym imprintingiem rodzicielskim. Domena telomerowa (tzw. centrum imprintingu 1, IC1 lub DMR1, differentially methylated region 1) zawiera geny IGF2 i H19. Domena centromerowa 2 (IC2, DMR2) obejmuje około 10 genów z nałożonym imprintingiem, kodujących inhibitor kinaz zależnych od cyklin 1C p57KIP2 (CDKN1C lub p57kip2), podjednostkę kanału potasowego bramkowany potencjałem (KCNQ1) i odpowiadający mu transkrypt (KCNQIOTI lub LIT1) [120, 122].

Większość defektów genetycznych związanych z BWS jest skutkiem utraty imprintingu, spowodowanej nieprawidłową metylacją w regionie IC2, a większość rodzinnych przypadków wynika ze zmian w genie CDKN1C lub mikrodelecji w IC1, dziedziczących się w sposób autosomalny dominujący [121, 123]. Innym genem powiązanym z BWS jest NSD1 (5q35.2-q35.3). Baujat i wsp. opisali mutacje tego genu w niewielkiej liczbie pacjentów z BWS, sugerując, że imprinting w regionie 11p15 jest regulowany przez produkt tego genu, białko 1 receptora jądrowego zawierające domenę SET (nuclear receptor binding SET domain protein 1). Działa ono również jako współregulator receptora androgenowego [124].

Mnoga gruczolakowatość wewnątrzwydzielnicza

Mnoga gruczolakowatość wewnątrzwydzielnicza (OMIM 131100) to wysoce penetrująca, autosomalna dominująca przypadłość, charakteryzująca się występowaniem nowotworów przytarczyc, trzustki, przedniego płata przysadki, grasicy (rakowiaka), tarczycy (gruczolaka), a u prawie 40% pacjentów – nowotworów i rozrostu kory nadnercza. Rak kory nadnercza występuje, ale jest niezwykle rzadki. Większość rodzin dotkniętych MEN1 (75-95%) posiada heterozygotyczną inaktywującą mutację linii zarodkowej w genie MEN1 (11q13.1) [125, 126], występują również duże delecje. Białko menin, tkankowo-specyficzny supresor nowotworowy, oddziałuje z takimi białkami jak czynniki transkrypcyjne (np. Jun D, NFκB i Smad3) czy metylotransferazy histonu H3 (np. MLL, MLL2) [127]. W związku z tym, pole jego działania to regulacja cyklu komórkowego, proliferacji i apoptozy [128]. Wpływ białka menin na wzrost komórek wydaje się podlegać skomplikowanemu mechanizmowi, ponieważ działa jako supresor w komórkach endokrynnych, ale jako aktywator w niektórych typach komórek białaczkowych [127].

Rodzinna polipowatość gruczolakowata

Rodzinna polipowatość gruczolakowata (FAP) 1 oraz jej wariant zespół Gardnera (OMIM 175100) to zaburzenia dziedziczone autosomalnie dominująco. Zazwyczaj FAP charakteryzuje się występowaniem setek do tysięcy polipów gruczolakowatych jelita grubego i jego rakiem [129], zaś zespół Gardnera wiąże się z polipowatością przewodu pokarmowego i takimi zmianami, jak: kostniaki, torbiele epidermoidalne, hepatoblastoma, rak brodawkowaty i pęcherzykowy tarczycy oraz gruczolaki nadnercza [130]. Molekularnej przyczyny leżącej u podstaw tych zespołów doszukano się w locus 5q22.2, które zawiera gen APC (adenomatous polyposis coli), będący supresorem nowotworów poprzez obniżanie aktywności β-kateniny. Gdy zabraknie regulacji poprzez APC następuje akumulacja β-kateniny w jądrze komórkowym, co prowadzi do aktywacji genów zaangażowanych w rozpoczęcie i postępowanie cyklu komórkowego. Zmiany patogenne w genie APC to głównie mutacje przesuwające ramkę odczytu lub nonsensowne, a następnie duże delecje genowe i zmiany splicingu [129]. U pacjentów z FAP zaobserwowano zwiększone ryzyko ACC w porównaniu z ogólną populacją. Wyjaśnieniem może być fakt, że podwyższone stężenie β-kateniny może odgrywać rolę w powstaniu ACC, jako że to białko silnie aktywuje wachlarz genów niezbędnych do rozwoju i homeostazy tkanki kory nadnerczy [131, 132].

Obiecujące terapie celowane w raku kory nadnercza

Jak wspomniano wyżej, kaskady PI3K/Akt/mTOR i Ras/Raf/MEK/ERK współdziałają i regulowane są przez wiele elementów sygnalizacji komórkowej; obydwie inicjowane są poprzez aktywację TKR. Najnowsze doniesienia wskazują, że szereg elementów tych kaskad może stanowić obiecujące cele terapii ACC, a inhibitory PI3K/mTOR wywierają działanie antyproliferacyjne w komórkach raka kory nadnercza [99, 133-141].

Fassnacht i wsp. opisali zwiększenie całkowitej ekspresji białka Akt w ACC, ale nie w ACA lub normalnej tkance. Ta grupa badawcza zbadała także poziom ufosforylowanego Akt (pAkt) i wykazała, że w rzeczywistości wskaźnik pAkt/Akt nie jest zmieniony w ACC [142]. Jednakże inne badania wykazały, że ekspresja pAkt jest zwiększona w ACC [34]. Ponadto, stężenie mTOR, fosfo-mTOR i białka raptor jest znacznie zwiększone w guzach kory nadnercza. Zatem aktywność mTOR jest wyższa w ACT niż w grupie kontrolnej. Z drugiej strony, stężenie białka rictor był poniżej poziomu wykrywalności w nowotworowej i normalnej tkance kory nadnerczy [99].

W kilku doniesieniach dotyczących białek Ras opisano nadekspresję rnRNA KRAS i mutacje w genie KRAS w łagodnych nowotworach nadnercza [143], rakach [82], jak również mutacje w genie NRAS zarówno w ACC, jak i ACA [82,144]. Z drugiej strony, inne badania wykazały brak mutacji tych genów i genu HRAS (HRas) w nowotworach nadnercza [144-146]. Ponadto Kotoula i wsp. opisali aktywujące mutacje w genie BRAF (B-Raf) w niemal 6% badanych przypadków ACC [82]. Obserwacje te sugerują, że zmiany w genach kodujących elementy rodziny Ras i Raf mogą pojawić się w nowotworach nadnercza, jednak nie występują one często.

Molekularne metody badawcze

Szereg genów podatności, opisanych w przypadkach zespołów rodzinnych był początkiem molekularnego określania złośliwości guza i jego odróżnienia od nowotworów łagodnych. Badania genomu, takie jak analiza transkryptomu, pozwalają kwalifikować nowotwory do klastrów o podobnym profilu molekularnym i rokowniczym. Jest to być może punkt zwrotny w diagnostyce i leczeniu nowotworów kory nadnercza.

Metody, które umożliwiły takie analizy, to: analiza mikrosatelitarnych sekwencji, porównawcza hybrydyzacja genomowa (CGH, comparative genomie hybridisation) (zarówno konwencjonalna, jak i oparta na macierzach), mikromacierze cDNA, oligonukleotydowe, SNP, miRNA oraz macierze PCR. Wiele grup badawczych przeprowadziło badania ekspresji dużej liczby genów w nowotworach kory nadnercza. Badania z zastosowaniem markerów mikrosatelitarnych pozwalają zidentyfikować regiony genomu, gdzie często występuje LOH [35, 125], natomiast porównawcza hybrydyzacja genomowa umożliwia ocenę zmian liczby kopii w całym genomie [25, 147-152]. Główną wadą konwencjonalnej CGH jest ograniczona rozdzielczość (2 Mbp dla amplifikacji i 10-20 Mbp dla delecji pojedynczej kopii), co sprawia, że nie jest przydatna w wykrywaniu zmian na poziomie locus. Ten problem został rozwiązany w macierzach CGH, które umożliwiają wykrywanie zmian liczby kopii DNA na poziomie genów, analizując pojedyncze locus za locus [153]. W ostatnim czasie wiele projektów badawczych było poświęcone ocenie nowotworów kory nadnercza za pomocą macierzy CGH [20, 46, 147, 154].

Do innych typów mikromaderzy DNA wykorzystywanych w badaniach ACT należą: mikromacierze cDNA, oligonukleotydowe i SNP Pierwsze dwa typy stanowią podstawę badań mających na celu ocenę profilu ekspresji. Te metody nieznacznie się od siebie różnią, jeśli chodzi o precyzję i niezawodność. Liczba badań opartych na mikromacierzach cDNA [31, 37, 83, 85, 91, 155, 156] jest porównywalna z liczbą badań z użyciem Affymetrix GeneChips (są to wysokiej gęstości mikromacierze oligonukleotydowe) [19, 21, 32, 33, 52, 92, 94, 157-160]. Badania polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP, single nucleotide polymorphism) w guzach kory nadnercza z użyciem macierzy SNP są nieliczne [73, 161, 162]. Mikromacierze SNP umożliwiają wykrycie zmian liczby kopii i TOH. Innym rodzajem dedykowanego chipa jest mikromacierz mikroRNA, która umożliwia badanie całej populacji miRNA na poziomie genomu [90, 96-98, 100]. Technologia mikromacierzy umożliwia także badania profilu metylacji, co może być kolejnym sposobem na odróżnienie nowotworów złośliwych od łagodnych [163-165]. Macierze PCR są najbardziej przydatne w badaniach określonej grupy genów, przykładowo genów związanych z określoną ścieżką sygnalizacyjną [155, 166, 167].

Techniki wykorzystywane do weryfikacji wyników badań na poziomie genomu obejmują immunohistochemię, Western blotting, qPCR oraz fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH, fluorescence in situ hybridisation). Poza analizami transkryptomu, jedną z najczęśdej stosowanych metod w badaniach przesiewowych dużej liczby próbek są mikromacierze tkankowe, szczególnie często wykorzystywane w badaniach immunohistochemicznych guzów kory nadnercza [21, 34, 51, 52, 67, 69, 80, 168].

Wybrane terapie celowane w raku kory nadnercza

Niedawne badania, które przyczyniły się do zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw ACC, umożliwiły badania kliniczne terapii celowanych. Jednakże ich wyniki są nadal niezadowalające. Doniesienia o terapiach ratunkowych z wykorzystaniem środków ukierunkowanych na konkretne cząsteczki są jeszcze mniej pomyślne. Należy jednak zauważyć, że te środki badano u pacjentów z ACC z bardzo złym rokowaniem przez zaawansowane stadium choroby, u których nie uzyskano odpowiedzi na wcześniejszą chemioterapię.

Jak wspomniano powyżej, w większości przypadków ACC zaobserwowano zwiększoną ekspresję genu IGF2 [21, 24, 26, 31-36]. Nadekspresja IGF1R również odgrywa rolę w patogenezie ACC [34, 36], ale wydaje się być specyficzna dla ACC wieku dziecięcego [39, 40]. Obiecujące dane przedkliniczne opisujące zmniejszenie proliferacji w ACC w wyniku hamowania IGF1R [34] były podstawą I fazy badań klinicznych inhibitorów IGF1R. W przypadku monoklonalnego przedwciala anty-IGF1R, figitumumabu, opisano aktywność biologiczną w ACC opornym na leczenie [169]. W innym badaniu klinicznym (I faza) oceniono skuteczność kombinacji inhibitora IGF1R, ebeutumumabu, z inhibitorem mTOR, temsyrolimusem, u pacjentów z przerzutującym ACC. U jedenastu spośród 26 pacjentów włączonych do badania (42%) choroba ustabilizowała się na 6 miesięcy, wskazując na aktywność biologiczną tego rodzaju leczenia przerzutującego ACC [170]. Niestety, w wieloośrodkowym badaniu II fazy z losowym przydziałem leczenia u chorych z nawrotowym/przerzutującym nieoperacyjnym ACC nie udało się potwierdzić skuteczności kombinacji cixutumumabu z mitotanem jako terapii pierwszego rzutu. To połączenie okazało się skuteczne w niektórych podgrupach pacjentów, ale ogólnie wykazało stosunkowo niską skuteczność terapeutyczną, która uniemożliwiła dalsze badania [171]. Inny inhibitor IGF1R, Linsitinib (OSI-906), wykazał obiecujące właściwości przeciwnowotworowe w badaniach wstępnych, dzięki czemu rozpoczęto badania kliniczne. Jednakże, w III fazie badań klinicznych z podwójną ślepą próbą i z losowym przydziałem leczenia u chorych z miejscowo zaawansowanym lub przerzutującym ACC, Linsitinib nie okazał się skuteczny w poprawie przeżycia całkowitego, sugerując, że ten rodzaj leczenia nie jest skuteczny w leczeniu tego rodzaju nowotworów [172].

Jako że mTOR jest białkiem docelowym szlaku sygnalizacyjnego IGF2, inhibitor mTOR, ewerolimus (pochodna rapamycyny), jest obiecującym rodzajem leczenia ACC.W badaniach in vitro wykazano, że ewerolimus hamuje proliferację komórek ACC [99, 134, 173, 174]. Jednakże w badaniach klinicznych nie wykazano odpowiedzi na leczenie ewerolimusem u czterech pacjentek z zaawansowanym ACC. Ta kohorta obejmowała pacjentki, u których po operacji rozwinęło się IV stadium choroby i których stan się pogorszył pomimo leczenia mitotanem i innymi środkami, w tym chemioterapią, talidomidem i antagonistą IGF1R. Ewerolimus wprowadzono do leczenia (u 2 z 4 pacjentek kontynuowano leczenie mitotanem), ale nie udało się zapobiec progresji choroby u żadnej z nich [175].

Jednym z markerów złośliwości guza nadnercza jest EGFR [80], jednakże jego mutacje w eksonach 18-21 występują jedynie w co najwyżej 11% przypadków ACC [82, 176]. Erlotynib to inhibitor kinazy tyrozynowej, specyficzny względem EGFR, zatwierdzony przez amerykańską Agencję Żywności i Leków (FDA, Food and Drug Administration) jako środek leczniczy w raku płuca. Wyniki badań przedklinicznych erlotynibu w liniach komórkowych ACC i kulturach pierwotnych są obiecujące [177-179]. Skuteczność leczenia skojarzonego (erlotynib z gemcytabiną) jako terapii ratunkowej zbadano w grupie pacjentów z postępującym ACC, którzy otrzymali wcześniej dwa do czterech rodzajów leczenia. Tylko u jednego na 10 pacjentów zaobserwowano niewielką odpowiedź na leczenie, natomiast u 8 pacjentów choroba znacznie postąpiła, co wskazuje na to, że ta chemioterapia ratunkowa nie jest skuteczna u pacjentów z bardzo zaawansowanym ACC [180].

Podsumowanie, wnioski końcowe oraz dalsze kierunki badań

Badania molekularne elementów ścieżek sygnalizacyjnych w guzach kory nadnercza uwidoczniły spektrum zmian zarówno na poziomie sekwencji DNA, jak i w ekspresji. Wiele z nich wykazuje odmienny profil w raku kory nadnercza i w gruczolaku, definiując w ten sposób wskaźniki złośliwości i dostarczając obiecującego narzędzia diagnostycznego. Ocena proliferacji za pomocą indeksu Ki-67 należy do obecnie rozwijanych markerów diagnostycznych [181]. Podobnie w przypadku steroidogennego czynnika 1, który wykazuje dużą przydatność jako marker diagnostyczny i rokowniczy. Jego zwiększona ekspresja koreluje z bardziej zaawansowanym stadium guza i gorszym rokowaniem [68]. Inne zmiany molekularne o obiecujących właściwościach obejmują: podwyższony poziom insulinopodobnego czynnika wzrostu II, czynników wzrostu fibroblastów 1 i 4 oraz cyklin (Dl, El i E2). Ich wykorzystanie w praktyce klinicznej musi najpierw zostać starannie opracowane i zweryfikowane. Ponadto zmienione geny, miRNA i/lub białka stanowią obiecujące cele bardziej zindywidualizowanego leczenia ACC.

Dalsze badania mogą przyczynić się do rozwoju nowych sposobów leczenia nowotworów z pooperacyjnym nawrotem choroby i/lub przerzutami, obecnie leczonych mitotanem w monoterapii lub w skojarzeniu z lekami cytotoksycznymi, co wiąże się z wieloma działaniami niepożądanymi. Wiele środków wykazuje obiecujące właściwości lecznicze w przypadkach ACC, są to między innymi: antagoniści receptora IGFIR (NVPAEW541, IMC-A12, figitumumab (CP-751,871), OSI-906), antagoniści β-kateniny (PKF115-584), odwrotni agoniści SF-1 (pochodne izochinolinony), oraz antagoniści mTOR (rapamycyna, sirolimus i jego pochodne, ewerolimus (RAD001) i temsirolimus) [13, 182]. Jednakże leczenie pojedynczym lekiem, przykładowo ewerolimusem, może nie być skuteczne w leczeniu złośliwych nowotworów kory nadnercza, a negatywne oddziaływania z innymi środkami leczniczymi, takimi jak mitotan, powinny zostać wzięte pod uwagę [175].

Podsumowując, rozwój wiedzy na temat zmian molekularnych, zwłaszcza elementów szlaków sygnalizacyjnych, w nowotworach kory nadnercza może przyczynić się do postępu w zakresie dostępnych metod diagnostycznych, rokowniczych i leczniczych.

Podziękowania

Dr hab. med. Dorota Dworakowska jest laureatką grantu ‘Pomost’ (POMOST/2012-5/3) Fundacji na Rzecz Nauki Polskiej, współfinansowanego przez Unię Europejską w ramach Regionalnego Programu Rozwoju. Paulina Szyszka była doktorantką doc. Dworakowskiej w ramach tego grantu.