Artykuł oryginalny • Original article

Znaczenie czynników VEGF i VEGFR w klinicznej ocenie chorych na raka wątrobowokomórkowego

Włodzimierz Otto1, Maria Król2, Ewa Wilczek3, Janusz Sierdziński4,
Magdalena Feliksbrot-Bratosiewicz5, Urszula Wilkowojska6, Marek Krawczyk7

Grant No. NN 403 177940 Narodowego Centrum Nauki

Wstęp

Naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostu VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) jest jednym z najsilniej działających promotorów angiogenezy, uważanej za istotny proces w rozwoju raka wątrobowokomórkowego (HCC) [1, 2].

Dane przytaczane w licznych pracach wskazują, że wysoki poziom koncentracji VEGF obecny w surowicy krwi oraz w tkance guza przemawia za intensywnym rozwojem nowotworu i jest złym czynnikiem prognostycznym [3, 4]. Nie brak jednak doświadczeń i obserwacji klinicznych negujących znaczenie czynnika VEGF w rozwoju HCC (hepatocellular carcinoma), a zwłaszcza jego roli w progresji nowotworowej [5, 6]. Kontrowersje budzi także znaczenie badań aktywności VEGF w klinicznej ocenie chorych i podejmowaniu decyzji o sposobie ich leczenia [7–12].

W pracy przedstawione zostały wyniki badań poziomu expresji VEGF i jego receptora VEGFR-2 we krwi obwodowej i w tkance wyciętego raka wątrobowokomórkowego. Jej celem było ustalenie wzajemnych relacji pomiedzy krążącym i tkankowym czynnikiem VEGF, charakterystyką patomorfologiczną guza i oceną kliniczną stopnia zaawansowania nowotworu u chorych chirurgicznych leczonych na HCC.

Materiał i metody

Badaniem objęto łącznie 146 chorych na raka wątrobowokomórkowego. Każdy wyraził pisemną zgodę na udział w badaniu, zaaprobowanym przez Komisję Bioetyczną Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego (Grant Narodowego Centrum Nauki, No. NN 403 177940/E154). Na podstawie stopnia zaawansowania klinicznego chorych z HCC zakwalifikowano do trzech grup postępowania:

— do resekcji wątroby — Grupa A — zaliczono 53 chorych (31 M, 22 K, średnia wieku 55 lat), u których rozpoznano guz w I stopniu zaawansowania klinicznego (T1, N0, M0, O-A1 wg oceny BCLC — Barcelona Clinic Liver Cancer), w okresie wydolności wątroby. U 29 guz rozwinął się w wątrobie zdrowej, u 24 w wątrobie marskiej po przebyciu wirusowego zapalenia wątroby HBV/HCV; u 9 z nich stwierdzono chorobę alkoholową (ALD). Poziom alfa-fetoproteiny w surowicy krwi wynosił średnio 15,5 ng/mL (SD+/-1457), liczba płytek krwi 160 × 109/L (SD+/-74000), INR 1,06 (SD+/-0,14);

— do transplantacji wątroby — Grupa B — zaliczono 49 chorych (34 M, 15 K, średnia wieku 50 lat), u których rozpoznano guz w II stopniu zaawansowania klinicznego (T1/T2, N0, M0), pojedynczy guz < 5 cm lub 3 guzy o średnicy < 3 cm, tj. spełniający „kryteria mediolańskie, A2-A4 wg oceny BCLC), w okresie wydolności wątroby (wątroba marska w grupie wydolności A/B wg Childe’a). U wszystkich przyczyną marskości było zakażenie wirusowe HBV/HCV; u 10 potwierdzono chorobę alkoholową. Poziom alfa-fetoproteiny wynosił średnio 43,35 ng/mL (SD+/-3444), liczba płytek krwi 75 × 109/L (SD+/-46000), INR 1,13 (SD+/-0,13);

— do leczenia paliatywnego — Grupa C — zaliczono 44 chorych (24 M, 20 K, średnia wieku 61 lat), u których rozpoznano zaawansowanego raka w wątrobie zdrowej lub marskiej (stopień kliniczny III/IVB-C wg oceny BCLC). U 8 chorych guz rozwinął się w zdrowej wątrobie, u 34 w wątrobie marskiej w przebiegu zakażenia HBV/HCV; u 10 potwierdzono chorobę alkoholową. Poziom alfa-fetoproteiny u chorych wynosił średnio 59,05 ng/ml, (SD+/-1748), liczba płytek krwi 123 × 109/L (SD+/-82000), INR 1,13 (SD+/-0,13).

W okresie poprzedzającym leczenie (1–3 dni przed operacją lub po decyzji o leczeniu paliatywnym) od chorych pobierano próbki krwi. Dla oznaczenia w badaniu cytometrycznym progenitorowych komórek endotelialnych pobierano 2 ml krwi żylnej na odczynnik K3EDTA. Próbkę analizowano niezwłocznie, oznaczając odsetek komórek o fenotypie CD34+,309+,45+ i CD34+,309+,45-, zgodnie z procedurą wieloparametrycznego bramkowania aprobowanego przez International Society of Hematology and Graft Engineering (ISHAGE), opisanego szczegółowo w poprzednio raportach [13–15]. Wyniki podano jako sumę odsetka komórek o fenotypie CD309+ w subpopulacji komórek macierzystych CD34+.

Na badanie serologiczne poziomu koncentracji VEGF w surowicy krwi pobierano 8 ml krwi, z której surowicę, po odwirowaniu próbki z szybkością 3000 obrotów/minutę przez okres 10 minut, składowano w temperaturze –800 C. Koncentrację VEGF oznaczano za pomocą testu immunoenzymatycznego (Quantikine Human VEGF Immunoassay, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA); 100 μl standardu rekombinowanego ludzkiego czynnika VEGF łączono z próbką badanej surowicy, rozcieńczano, nanoszono na płytkę pokrytą mysim monoklonalnym przeciwciałem specyficznym dla VEGF i inkubowano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po spłukaniu do próbki dodawano peroksydazę chrzanową i poliklonalne przeciwciało specyficzne dla VEGF i po kolejnym spłukaniu — 3,3’,5,5’ substrat tetrametylobenzudyny (TNB). Czułość metody wynosiła 9 pg/ml, a współczynnik precyzji badania i pomiędzy badaniami wynosił 4,4–6,7% i 6,2–8,8%.

Histopatologicznie zbadano 102 guzy wycięte operacyjnie i 44 wycinki pobrane podczas biopsji gruboigłowych u chorych leczonych paliatywnie. Preparaty utrwalono w 10-procentowej formalinie i zatopiono w parafinie. Bloczki tkanki skarawano na sekcje grubości 4 μm, wybarwiano hematoksyliną/eozyną. Oceniono stopień zróżnicowania guza wg skali Edmondsona-Steinera, wariant budowy (beleczkowy, pseudogruczołowy, lity) i obecność naciekania przez nowotwór mikrokrążenia.

Barwienie tkanek na obecność VEGF oraz VEGFR przeprowadzono techniką immunohistochemii, stosując przeciwciała anty-VEGForaz anty-EGFR (Dako Cytomation) i zestaw przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z cząsteczkami peroksydazy chrzanowej ImmPress Anty-Mouse-HRP Detection Kit (Vector Laboratories). Barwienia przeprowadzono w autostainerze Leica Bond-MAX (Leica). Procedura obejmowała odparafinowanie, odzyskiwanie antygenów w wysokiej temperaturze, blokowanie niespecyficznych wiązań 2,5-procentową surowicą końską, inkubację z przeciwciałami pierwszorzędowymi w stężeniu 1:100 i detekcję sygnału. Wizualizację barwienia uzyskano, stosując jako chromogenu 3,3’-diaminobenzydyny. Tkanki wybarwiono hematoksyliną dla uwidocznienia jąder komórkowych. Preparaty zamknięto w automatycznej zaklejarce. Poziom immunoreaktywności białek oznaczono techniką morfometrii przy użyciu automatycznego analizatora obrazu i programu Image Pro Plus (Media Cybernetics) w 5 reprezentatywnych polach widzenia. Analiza obejmowała pole powierzchni reakcji immunologicznej i natężenie reakcji. Uśrednionym poziomem immunoreaktywności białka VEGF w tkance był iloczyn średniego pola powierzchni i średniego natężenia reakcji, wyrażony w jednostkach umownych (j.u.).

Dane zostały zapisane na dysku i analizowane w programie Statistica 6.0. Dane liczbowe przedstawione zostały jako średnia +/- SD, z przedziałem reprezentatywności próby 95% CI. Analizę statystyczną wzajemnych relacji badanych zmiennych przeprowadzono za pomocą testu Chi-kwadrat Kruskala-Wallisa i testu U Manna-Whitneya, a korelacje zachodzące pomiędzy zmiennymi oceniono testem Spearmana. Wyniki analizy o wartości p < 0,05 uznano za znamienne statystycznie.

Wyniki

W ocenie klinicznej (klasyfikacja TNM, Childa-Pugha, BCLC, „kryteria mediolańskie”), chorzy z grupy A,B,C, różnili się w istotny sposób stopniem zaawansowania choroby nowotworowej, średnim poziomem AFP w surowicy krwi (Chisq = 6,2; p < 0,04), liczbą płytek krwi (Chisq = 50,32; p < 0,001) i wskaźnikiem INR Chisq = 31,13; p < 0,001).

W grupie chorych po resekcji wątroby (Grupa A) przeważały guzy o budowie litej, natomiast w grupach chorych po transplantacji (Grupa B) i chorych leczonych paliatywnie (Grupa C) — wariant beleczkowy guza (Chisq = 13,44; p < 0,001). Chorzy leczeni paliatywnie wyróżniali się większą liczbą inwazji nowotworu do naczyń mikrokrążenia (Chisq = 9,43; p < 0,01). Pomiędzy grupami nie było różnic istotnych statystycznie w stopniu dojrzałości nowotworu (NS).

Średnią wartość odsetka endotelialnych komórek progenitorowych CD34+,309+ (EPCs) u 146 chorych z HCC uczestniczących w badaniu ustalono na 43,89% CD34+, SD+/-16,25 (41,23–46,55 95% CI). Odsetek komórek EPCs w Grupie A wynosił średnio 37,13%, SD +/-12,64 (33,64–40,62 95% CI), w Grupie B 40,2%, SD+/-12,57 (36,58–43,81 95% CI), w Grupie C — 56,16, SD+/-17,7 (50,09–61,38 95% CI); Chisq =30,55; p < 0,001.

Poziom koncentracji białka VEGF w tkance guza wynosił 77,69 j.u., SD+/-12,99 (63,82–96,4 95% CI) w Grupie A, 80,85 j.u., SD+/-13,11 (77,09–84,64 95% CI) w Grupie B, 87,08 j.u., SD +/-10,5 (83,89–90,28 95% CI) w Grupie C; Chisq = 9,67, p < 0,008 (ryc. 1).

Rycina 1. Wynik barwienia immunohistochemicznego raka wątrobowokomórkowego na obecność VEGF. A — immunoreaktywność w prawidłowej wątrobie; B — słaba immunoreaktywności w komórkach HCC; C — średnio nasilona intensywność znakowania w komórkach HCC; D — obraz komórek raka powiększony 20 ×, pokazujący znakowanie zlokalizowane w cytoplazmie; powiększenie A–C 10 ×; D 20 ×

Poziom koncentracji białka VEGF-R w tkance guza wynosił110,11 j.u., SD+/-59,11 (93,82–126,4 95% CI) w Grupie A, 125,84 j.u., SD+/-48,29 (111,97–139,71 95% CI) w Grupie B, 161,69 j.u., SD +/-53,15 (145,53–177. 85 95% CI) w Grupie C; Chisq = 9,67; p < 0,001 (ryc. 2).

Rycina 2. Wynik znakowania immunohistochemicznego raka wątrobowokomórkowego na obecność EGFR. A — silna immunoreaktywność komórek raka; B — brak immunoreaktywności w komórkach HCC; C — średnio nasilona intensywność znakowania; D — znakowanie komórek raka położonych na obrzeżach gniazd nowotworowych. Skala — 100 µm

Poziom koncentracji białka VEGF w surowicy krwi wynosił średnio 352,56 pg/ml, SD+/-203,42 (296,49–408, 63 95% CI) w Grupie A, 317,46 pg/ml, SD 241,97 (247,96–386,96 95% CI) w Grupie B, 319,64 pg/mL, SD 333,18 (216,84–422,46 95% CI) w Grupie C; (N.S.).

Wariant budowy histologicznej guza, stopień dojrzałości i obecność naciekania przez guz naczyń mikrokrążenia nie wpływał w istotny sposób na różnice w poziomie czynników angiogenezy (NS).

Tabela I. Wyniki badań czynników angiogenezy u 146 chorych z HCC ocenianych w programie

Dyskusja

Naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostu VEGF wywiera bezpośredni lub pośredni wpływ na wiele czynników stymulujących proces angiogenezy [16, 17]. Interakcja pomiędzy VEGF i receptorami VEGFR prowadzi między innymi do mobilizacji ze szpiku kostnego endotelialnych komórek progenitorowych (EPCs), charakteryzujących się pozytywną reakcją z przeciwciałami różnicowania powierzchniowego CD34 i CD309. EPCs uczestniczą w budowie patologicznego ukrwienia rozwijającego się raka, a ich liczba we krwi obwodowej wzrasta wraz z rozwojem nowotworu [18]. Wieloośrodkowe badania wskazują, że oznaczenie ilościowe populacji EPCs we krwi obwodowej umożliwia rozpoznanie i ocenę stopnia zaawansowania HCC, ustalenie rokowania, a także monitorowanie przebiegu choroby i wyników jej leczenia [19–21]. W badaniu przedstawionym w pracy średnią wartość odsetka endotelialnych komórek progenitorowych (EPCs) we krwi obwodowej wszystkich chorych na HCC, których włączono do badania, ustalono na 43,89 % (SD+/-16,25; 41,23–46,55 95% CI) populacji komórek CD34+. Endotelialne komórki progenitorowe (EPCs) stanowiły nieliczną subpopulację komórek o fenotypie CD309+ pośród komórek hematopoetycznych CD45+ i komórek śródbłonka naczyniowego CD45-. Stwierdzono istotne statystycznie różnice w odsetku EPCs pomiedzy chorymi zdatnymi do leczenia chirurgicznego i chorymi, których stan to leczenie wykluczał. Wyniki te wskazują jednoznacznie na wzrost potencjału angiogenezy guza w zależności od stopnia jego zaawansowania klinicznego i potwierdzają doświadczenia w tym zakresie wielu ośrodków na świecie [22–24].

W badaniu wykazano również zależność pomiędzy nadekspresją tkankową białek VEGF oraz VEGFR a klinicznym stopniem zaawansowania nowotworu. Prawidłowość ta zwraca uwagę badających zjawiska angiogenezy nowotworowej od czasu doniesień Misego w 1996 roku [12]. Dla określenia koncentracji czynnika VEGF i jego receptora w tkance HCC wykorzystano w pracy technikę immunohistochemii. W odróżnieniu od innych badań tego typu [6, 8, 21] do pomiaru poziomu immunoreaktywności badanych białek wykorzystano technikę morfometrii. Jej istotą jest densytometria przy użyciu automatycznego analizatora obrazu i programu Image Pro Plus (Media Cybernetics) i wyrażenie poziomu immunoreaktywności badanych białek w jednostkach umownych (j.u.). Tak określony poziom koncentracji VEGF i VEGFR wydaje się dużo bardziej precyzyjny i wiarygodny niż procentowe określenie komórek o pozytywnie wybarwionej cytoplaźmie, w arbitralnie wybranych polach widzenia [2, 6, 10, 21, 25]. Badania wykazały istotne statystycznie różnice pomiędzy badanymi grupami chorych, a także związek pomiędzy poziomem koncentracji białek VEGF i VEGFR w tkance guza i stopniem klinicznym zaawansowania choroby, ocenianym za pomocą standardowych systemów klasyfikacji. Poziom koncentracji białka VEGF w tkance guza odpowiada potencjałowi nowotworu do angiogenezy, a zatem do bardziej ekspansywnego rozwoju i większej złośliwości. Ogólnoustrojową emanacją expresji tkankowego VEGF, a zarazem przejawem jego oddziaływania jest zwiększona liczba endotelialnych komórek progenitorowych w krążeniu obwodowym. Powiązanie to, jak również związek ekspresji wymienionych czynników angiogenezy, wykazane zostało w omawianym badaniu.

Badanie nie wykazało natomiast istotnych statystycznie różnic w poziomie koncentracji naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu VEGF w surowicy krwi, a także istotnej korelacji pomiedzy koncentracją VEGF w surowicy i pozostałymi zmiennymi. Poziom koncentracji VEGF wynosił średnio 329,88 pg/ml i był najwyższy u chorych z grupy A, tj. chorych ze zdrową lub wydolną wątrobą, a najniższy u chorych z grupy B, tj. chorych z marskością wątroby. W piśmiennictwie istnieją duże rozbieżności co do oceny wpływu białka VEGF na rozwój HCC. Podwyższony poziom koncentracji VEGF w surowicy krwi wydaje się być wczesnym etapem uogólnienia HCC, poprzedzającym rozsiew choroby i tworzenie się przerzutów odległych [2, 6–8, 20–22, 24–26]. Wykazano również korelację pomiedzy wysokim poziomem koncentracji czynnika VEGF w surowicy krwi i obecnością naciekania przez nowotwór naczyń mikrokrążenia [1, 21, 27, 28]. Złe rokowanie dotyczy zwłaszcza chorych z guzami charakteryzującymi się poziomem VEGF przekraczającymi 400 pg/ml i jednoczesnym wysokim poziomem ekspresji metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej (Matrixmataloproteinaze — MMP-2, MMP-9). U wymienionych chorych stwierdzono zarówno zwiększoną liczbę nawrotów po radykalnym leczeniu chirurgicznym, jak i obniżenie całkowitej przeżywalności oraz czasu przeżywalności bez choroby [6, 23]. Przytoczone doświadczenia kontrastują z równie licznymi doniesieniami o niskich poziomach koncentracji czynnika VEGF u chorych z HCC, które nie odbiegają od wartości znajdowanych w surowicy krwi ludzi zdrowych. Tan i wsp. [26] nie stwierdzili istotnych statystycznie zależności pomiedzy poziomem koncentracji VEGF w surowicy krwi i charakterystyką patomorfologiczną guza u chorych z HCC leczonych przeszczepieniem wątroby. Poon i wsp. [20] określili średni poziom koncentracji VEGF w surowicy krwi u chorych na HCC na 269 pg/ml, przy czym nie udało im się wykazać znaczacego związku pomiędzy koncentracją VEGF i wieloma parametrami funkcji watroby oraz przebiegiem choroby. Nie znaleźli także istotnych różnic w poziomie czynnika VEGF w surowicy krwi chorych z nawrotem i chorych pozostających wolnymi od nowotworu po przebyciu radykalnego leczenia operacyjnego. W piśmiennictwie wymienia się różne przyczyny tak rozbieżnych ocen. Wpływ mogą mieć różnice rasowe wśród chorych z HCC — wyższe i powiązane z przejawami klinicznymi choroby poziomy koncentracji białka VEGF w surowicy krwi u chorych z Chin, a niższe i niepowiązane, u Japończyków czy przedstawicieli rasy kaukaskiej [8, 20, 25–28]. Znaczenie ma także czy rak rozwinął się w wątrobie na tle zakażenia wirusem HBV, jak u większości chorych w Chinach, czy też na tle zakażenia HCV, przeważającego w krajach Zachodu [25, 26, 28]. Dowiedziono ponadto, że poziom białka VEGF w surowicy krwi zależy w istotny sposób od liczby płytek krwi [7, 8, 20]. Może być zatem wyższy u chorych mających guz w zdrowej, a przede wszystkim w wydolnej wątrobie, tj. zwykle kandydatów do resekcji wątroby, a niższy — u chorych z guzem i małopłytkowością w przebiegu marskości wątroby, tj. u chorych, u których z wyboru metodą leczenia chirurgicznego HCC jest transplantacja wątroby. Tak jak u chorych ocenianych w badaniu.

Rak wątrobowokomórkowy jest procesem ogólnoustrojowym, rozwijającym się w większości przypadków u chorych na marskość wątroby, zwłaszcza w marskości związanej z zakażeniem wirusami hepatotropowymi HBV/HCV. Na obecnym etapie wiedzy szansa wyleczenia istnieje tylko w przypadku guzów małych, dobrze zróżnicowanych i znajdujących się na wczesnym etapie rozwoju, tj. w I/II stopniu zaawansowania klinicznego. Stwarza ją jedynie leczenie chirurgiczne, resekcja lub transplantacja wątroby. Kandydaci wymagają starannej i właściwej oceny, którą przeprowadza się za pomocą standardowych, klinicznych systemów klasyfikacji BCLC, MELD, Childa-Pugha. Oznacza się zarazem stopień zaawansowania raka wg TNM, choć informacje te zostają zweryfikowane i dostępne są dopiero po badaniu patomorfologicznym. Pomimo starannie dobranych kryteriów i restrykcyjnego sposobu ich przestrzegania przy kwalifikacji chorych do leczenia resekcją lub transplantacją wątroby podawana w piśmiennictwie częstość nawrotów choroby przekracza 25–40% (zależnie od statystyk) w ciągu pierwszych trzech lat od operacji [3–5, 8, 20, 21, 27, 28]. Doświadczenia te skłaniają do poszukiwania dodatkowych kryteriów oceny, bazujących w znacznie większym stopniu niż obecnie na charakterystyce patomorfologicznej guza i jego właściwościach [2, 6, 23]. Jednym z kierunków są badania nad mechanizmami związanymi z procesem angiogenezy nowotworowej. Podwyższony poziom koncentracji naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu (VEGF — Vascular Endothelial Growth Factor) i jego receptora (VEGFR) w tkance guza jest jednym z przejawów intensywnej angiogenezy i zwiększonej aktywności biologicznej nowotworu. Klinicznym wykładnikiem tej aktywności jest zwiększona liczba progenitorowych komórek nabłonka naczyniowego (EPCs — Endothelial Progenitor Cells) w krążeniu obwodowym, tym większa, im bardziej jest zaawansowany proces nowotworowy. Ocena obu czynników, tj. krążących we krwi obwodowej EPCs i badanie koncentracji tkankowego VEGF/VEGFR stanowi istotny oraz godny polecenia element całościowej oceny chorych w procesie kwalifikacji do leczenia chirurgicznego.

Wnioski

Oznaczenie krążących endotelialnych komórek progenitorowych (EPCs) oraz białka VEGF i VEGFR w tkance HCC świadczy o potencjale guza do angiogenezy i wskazuje na stopień zaawansowania raka. Oznaczenie czynników angiogenezy jest wartościowym uzupełnieniem klinicznej oceny chorych.

Konflikt interesów: nie zgłoszono

Dr n. med. Janusz Sierdziński

Zakład Informatyki Medycznej i Telemedycyny

Warszawski Uniwersytet Medyczny

ul. Banacha 1a, 02–097 Warszawa

e-mail: jsierdzinski@wum. edu. pl

Piśmiennictwo

1. Yang ZF, Poon RT. Vascular changes in hepatocellular carcinoma. Anat Rec 2008; 291: 721–734.

2. Franchito A, Onori P, Renzi A i wsp. Expression of vascular endothelial growth factors and their receptors by hepatic progenitor cells in human liver diseases. Hepatobiliary Surg Nutrit 2013; 2: 68–77.

3. Zhu K, Dai Z, Zhou J. Biomarkers for hepatocellular carcinoma: progression in early diagnosis, prognosis, and personalized therapy. Biomark Res 2013; 1: 1–10.

4. Fan ST, Yang ZF, Ho DW i wsp. Prediction of posthepatectomy recurrence of hepatocellular carcinoma by circulating stem cells a prospective study. Ann Surg 2011; 254: 569–576.

5. Chan EY, Larson AM, Fix OK i wsp. Identifying risk for recurrent hepatocellular carcinoma after liver transplantation: implications for surveillance studies and new adjuvant therapies. Liver Transpl 2008; 14: 956–965.

6. Yegin EG, Siykhymbayev A, Eren F i wsp. Prognostic implication of serum vascular endothelial growth factor in advanced hepatocellular carcinoma staging. Ann Hepatol 2013; 12: 915–925.

7. Yu D, Chen J, Sun T i wsp. Mechanism of endothelial progenitor cell recruitment into neo-vessels in adjacent non-tumor tissues in hepatocellular carcinoma. BMC Cancer, 2010; 10: 435–445.

8. Shim JH, Park JW, Kim JH i wsp. Association between increment of serum VEGF level and prognosis after transcatheter arterial chemoembolization in hepatocellular carcinoma patients. Cancer Sci 2008; 99: 2037–2044.

9. Mise M, Arii H, Higashituji H i wsp. Clinical significance of vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor gene expression in liver tumor. Hepatology 1996; 23: 455–464.

10. Mathonnet M, Descottes B, Valleix D i wsp. VEGF in hepatocellular carcinoma and surrounding cirrhotic liver tissue. World J Gastroenterol 2006; 12: 830–831.

11. Kaseb A, Hanbali A, Cotant M i wsp. Vascular endothelial growth factor in the management of hepatocellular carcinoma: a review of literature. Cancer 2009; 115: 4895–4906.

12. Villanueva A, Llovet JM. Targeted therapies for hepatocellular carcinoma. Gastroenterology 2011; 140: 1410–1426.

13. Otto W, Król M, Maciaszczyk M i wsp. Identification and significance of circulating endothelial progenitor cells in patients with hepatocellular carcinoma. Nowotwory J Oncol 2013; 5: 383–394.

14. Otto W, Król M, Wilkowojska U i wsp. Tumor grading, architectural growth pattern and angiogenesis proprieties correlation in surgical patients treated for HCC. Int J Surg Res Pract 2014; 1: 2–12.

15. Otto W, Król M, Maciaszczyk M i wsp. Levels and values of circulating hematopoietic and endothelial progenitor cells in patients with hepatocellular carcinoma. J Liver 2014; 3: 4–14.

16. Zhu H, Shao Q, Sun X i wsp. The mobilization, recruitment and contribution of bone marrow-derived endothelial progenitor cells to the tumor neovascularization occur at an early stage and throughout the entire process of hepatocellular carcinoma growth. Oncol Rep 2012; 28: 1217–1224.

17. Zhu AX, Duda DG, Sahani DV i wsp. HCC and angiogenesis: possible targets and future direction. Nat Rev Clin Oncol 2011; 8: 292–301.

18. Yu D, Chen J, Sun X i wsp. Mechanism of endothelial progenitor cell recruitment into neo-vessels in adjacent non-tumor tissues in hepatocellular carcinoma. BMC Cancer 2010; 10: 435–445.

19. Sun XT, Yuan XW, Zhu HT i wsp. Endothelial precursor cells promote angiogenesis in hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol 2012; 18: 4925–4933.

20. Poon RT, Ng IO, Lau C i wsp. Serum vascular endothelial growth factor predicts venous invasion in hepatocellular carcinoma: a prospective study. Annals Surg 2001; 233: 227–235.

21. Chen CH, Chang LT, Tung WC i wsp. Levels and values of circulating endothelial progenitor cells, soluble angiogenic factors, and mononuclear cell apoptosis in liver cirrhosis patients. J Biomed Sci 2012; 19: 66–77.

22. Fadini GP, Baesso I, Albiero M i wsp. Technical notes on endothelial progenitor cells: ways to escape from the knowledge plateau. Atherosclerosis 2008; 197: 496–503.

23. Oishi N, Wang XW. Novel therapeutic strategies for targeting liver cancer stem cells. Int J Biol Sci 2011; 7: 517–535.

24. Beerepoot LV, Mehra N, Vermaat JS i wsp. Increased levels of viable circulating endothelial cells are an indicator of progressive disease in cancer patients. Ann Oncol 2004; 15: 139–145.

25. Tan A, Kim R, El-Gazzaz G i wsp. Serum vascular endothelial growth factor level in patients with hepatocellular carcinoma undergoing liver transplantation: experience of a single Western Center. Int J Org Transplant Med 2012; 3: 42–51.

26. Guo RP, Zhong C, Shi M i wsp. Clinical value of apoptosis and angiogenesis factors estimating the prognosis of hepatocellular carcinoma. J Cancer Res Clin Oncol 2006; 132: 457–555.

27. Kanematsu M, Osada S, Amaoka N i wsp. Expression of vascular endothelial growth factor in hepatocellular carcinoma and the surrounding liver and correlation with MRI findings. AJR 2005;184: 832–841.

28. Kwak BK, Shim HJ, Park ES i wsp. Hepatocellular carcinoma: correlation between vascular endothelial growth factor level and degree of enhancement by multiphase contrast enhanced computed tomography. Invest Radiol 2001; 36: 487–492.

1 Katedra i Klinika Chirurgii Ogólnej, Transplantacyjnej i Wątroby

2 Klinika Onkologii, Hematologii i Chorób Wewnętrznych,

3 Zakład Patomorfologii,

4 Zakład Informatyki Medycznej i Telemedycyny,

5 Klinika Onkologii, Hematologii i Chorób Wewnętrznych,

6 Klinika Onkologii, Hematologii i Chorób Wewnętrznych,

7 Katedra i Klinika Chirurgii Ogólnej, Transplantacyjnej i Wątroby

Centralny Szpital Kliniczny, Warszawski Uniwersytet Medyczny